Skillnad mellan PCR och RT PCR

Huvudskillnad - PCR vs RT-PCR

PCR och RT-PCR är två viktiga tekniker inom molekylärbiologi. PCR utvecklades av Kary Mullis på 1980-talet. Det kan öka antalet kopior av en viss gen på ett exponentiellt sätt, underlätta detektering av det specifika DNA-fragmentet. Taq Polymeras är det enzym som oftast används i PCR-system. Det är ett termostabilt enzym. I RT-PCR följs omvänd transkription av PCR. Enzymet, omvänt transkriptas är involverat i syntesen av komplementärt DNA från RNA. De huvudskillnad mellan PCR och RT-PCR är det PCR använder dubbelsträngat DNA som mall medan RT-PCR använder RNA som mall.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är PCR
      - Definition, Process, Application
2. Vad är RT PCR
      - Definition, egenskaper, tillämpning
3. Vad är skillnaden mellan PCR och RT PCR
      - Jämförelse av viktiga skillnader

Nyckelord: PCR, RT-PCR, Polymeraskedjereaktion, Reverse-transkription-Polymeraskedjereaktion, DNA-mall, DNA-polymeras, Denaturering, Annealing, Primerförlängning

Vad är PCR

PCR (Polymeraskedjereaktion) är en relativt enkel men revolutionerande metod. PCR använder enzymets, DNA-polymerasens förmåga att syntetisera nya DNA-strängar på ett komplementärt sätt till den erbjudna mallsträngen. PCR är en oumbärlig teknik som används i både kliniska och forskningslaboratorier för funktionell analys av gener, diagnos och övervakning av ärftliga sjukdomar, DNA-kloning, sekvensering och gammal DNA-amplifiering. DNA-mall, nukleotider, primrar och DNA-polymeras är de fyra huvudkomponenterna av PCR. De DNA-mall är vanligen ett dubbelsträngat DNA med målsekvensen, som skall amplifieras. Taq DNA-polymeras som är isolerad från Thermus vattenlevande ämnen används vanligen i PCR. De pfu DNA-polymeras är en annan typ av DNA-polymeras med hög trovärdighet. Både Taq och pfu polymeraser är värmebeständiga. De nukleotider som tillsätts av DNA-polymeraserna är adenin (A), guanin (G), cytosin (C) och tymin (T). Eftersom DNA-polymeras endast kan tillsätta en ny nukleotid i en 3'-ände av en existerande DNA-sträng krävs en oligonukleotidprimer för initiering av DNA-syntes. Kravet på en primer i PCR möjliggör avgränsning av endast en specifik region i mallen. Målsekvensen flankeras av framåtriktat och bakåtriktat primers. I slutet av en PCR ackumuleras nya kopior som kallas amplikoner av en specifik DNA-sekvens i miljarder. Komponenterna i PCR bör optimeras på ett sådant sätt att PCR-prestanda förbättras samtidigt som misslyckandet minimeras.

PCR är en automatiserad process som görs av termiska cykler, vilka kan byta mellan olika temperaturer. PCR är en trestegsprocess.

1. denaturering - Den dubbelsträngade DNA-mallen separeras i två enkla strängar genom uppvärmning till 94-95 ° C.
2. glödgning - De främre och bakre primrarna binder till de komplementära sekvenserna i mallen. Temperaturen för detta steg beror på smältpunkten för primerkombinationen.
3. Primerförlängning - DNA-polymerasenzym sträcker var och en av primrarna vid deras 3'end genom tillsats av komplementära baser till den växande strängen. Den optimala temperaturen på Taq polymeras, 72 ° C används som temperaturen i förlängningssteget. Utvidgningstiden beror på antalet baspar i mallsträngen.         

De tre stegen upprepas för 28-35 gånger.

Figur 1: Polymeraskedjereaktion

Produkten från PCR är storleksfraktionerad genom agarosgelelektrofores i jämförelse med en DNA-stege. Visualiseringen av DNA på en agarosgel görs genom färgning med etidiumbromid och observation under UV. De amplifierade DNA-banden under UV i en etidiumbromidfärgad gel visas i figur 2. DNA-stege visas i vänster brunn.

Figur 2: DNA-band

Vad är RT-PCR

RT-PCR (Omvänd transkriptions-polymeraskedjereaktion) är en av de mest känsliga teknikerna som används för detektering av mRNA. RNA är den lämpliga mallen för insamling av information antingen på genuttrycket av en normal vävnad eller genuttrycket av en infekterad vävnad. Mallen för RT-PCR kan vara antingen totalt RNA eller viralt eller bakteriellt RNA. RNA transkriberas omvänd till komplementärt DNA (cDNA) genom enzymet, omvänt transkriptas. Den optimala temperaturen för omvänt transkriptas är 46 ° C. CDNA används i PCR för att erhålla produkten. Steg i omvänd transkriptions-PCR visas i figur 3.

Figur 3: RT-PCR

RT-PCR kan utföras i tvåstegs eller enstegsreaktioner. I tvåstegsreaktionen utförs omvänd transkription och PCR i två separata steg. I enstegs RT-PCR följs omvänd transkription av PCR i ett enda rör på ett sekventiellt sätt. Både cDNA och slutlig PCR-produkt kan köras på en agarosgel för storleksfraktionerings- och visualiseringsändamål. Enstegs- och tvåstegs RT-PCR visas i figur 4.

Figur 4: Enstegs- och tvåstegs RT-PCR

Skillnad mellan PCR och RT-PCR

Definition

PCR: PCR är en teknik som används i molekylärbiologi för att amplifiera ett segment av DNA som genererar miljontals kopior av en DNA-sekvens.

RT-PCR: RT-PCR är en variant av PCR som används vid detektering av genuttryck i molekylärbiologi.

Steg

PCR: Denaturering, glödgning och förlängning är de tre stegen i PCR.

RT-PCR: I RT-PCR följs omvänd transkription av PCR. 

Mall

PCR: En dubbelsträngad DNA-molekyl tjänar som mallen för PCR.

RT-PCR: En enkelsträngad RNA-molekyl tjänar som mall för omvänt transkription. En enkelsträngs-DNA-molekyl tjänar som mall för PCR.

Enzymer används

PCR: DNA-polymeras används som enzymet i PCR.

RT-PCR: Omvänd transkriptas och DNA-polymeras används som enzymer i RT-PCR.

primers

PCR: Framåt och bakre primers används i PCR.

RT-PCR: Endast den bakre primern används för omvänd transkription och både fram- och bakprimrar används i PCR.

Känslighet

PCR: PCR är en känslig metod.

RT-PCR: RT-PCR är mer känslig för PCR.

tillämpningar

PCR: PCR används i funktionell analys av gener, diagnos och övervakning av ärftliga sjukdomar, DNA-kloning, DNA-sekvensering och gammal DNA-amplifiering.

RT-PCR: RT-PCR används för detektering av genuttryck.

Slutsats

PCR och RT-PCR är två viktiga tekniker som används i molekylärbiologi. Både PCR och RT-PCR är automatiserade tekniker som kan öka exponentialt antalet kopior av en mål-DNA-sekvens, vilken definieras av framåt- och bakåtprimrarna. I PCR används dubbelsträngad DNA som mall. Genom PCR kan DNA-kloning, DNA-sekvensering och funktionell analys av generna ske. I RT-PCR kan genuttryck i en viss vävnad observeras genom amplifiering av RNA. Huvudskillnaden mellan PCR och RT-PCR är i deras mallar som används i varje reaktion och deras tillämpningar.   

Referens:

1. "Polymeraskedjereaktion (PCR)." National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n.d. Webb. Tillgänglig här. 01 juni 2017.
2. "Polymeraskedjereaktion (eller PCR)." Kloning och molekylär analys av gener. N.p., n.d. Webb. Tillgänglig här. 01 juni 2017. 
3. Biolabs, New England. "CDNA Syntes & RT-PCR." CDNA Syntes & RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Webb. Tillgänglig här. 01 juni 2017.

Image Courtesy:

1. "Polymeraskedjereaktion" Av Enzoklop - Egent arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Av Rainis Venta - Egent arbete (CC BY-SA 3.0) via Wikimedia Commons
3. "Omvänd transkriptionspolymeras kedjereaktion" Av Jpark623 - Egent arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
4. "Ett steg mot tvåstegs RT-PCR" Av Jpark623 - Egent arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia