Skillnad mellan PCR-primer och sekvenseringsprimrar

Huvudskillnad - PCR Primers vs Sequencing primers
 

Med den senaste utvecklingen inom molekylärbiologi utvecklades olika genetiska tekniker som gjorde undersökningsprocesserna av olika vägar av ämnet enkelt och exakt. PCR och andra sekvenseringsprocedurer är två viktiga sådana tekniker. De använder olika delkomponenter. Primers anses vara den huvudsakliga delkomponenten som är gemensam för både PCR och sekvenseringstekniker. PCR-primrar används för amplifiering av en viss DNA-sekvens medan sekvesteringsprimrar används i sammanhanget med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikt att avslöja sin specifika ordning av nukleotidsekvensen. Det här är nyckelskillnad mellan PCR-primrar och sekvenseringsprimrar.

INNEHÅLL

1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är PCR Primers
3. Vad är Sequencing Primers
4. Likheter mellan PCR-primer och sekvenseringsprimrar
5. Jämförelse vid sida vid sida - PCR Primers vs Sequencing Primers i Tabular Form
6. Sammanfattning

Vad är PCR Primers?

Polymeraskedjereaktion (PCR) är en genetisk teknik som används inom molekylärbiologi för att förstärka ett eller flera kopior av ett visst DNA-segment och för att erhålla många miljoner identiska kopior. I en PCR-reaktion används olika komponenter inklusive primers. Primers är korta DNA-strängar med en nukleotidlängd av 18-25 vilket gör dem kompatibla med start- och ändregionen hos DNA-fragmenten som skall amplifieras. Primers kan vara en framåtriktad primer och omvänd primer. Dessa primers binder till DNA-fragmentet vid de specifika punkterna där det gör DNA-polymeras att binda till den specifika primern på platsen och initiera syntesen av den nya DNA-strängen.

Urvalet av primers är en viktig aspekt av PCR-processen. Urvalet av primerns längd är viktigt. Den ideala längden skulle vara 18-25 nukleotider. Om längden är för kort eller för lång, kommer primrarna inte att binda till DNA-sekvensen som ska amplifieras exakt. Primers som är för korta i längd leder till icke-specifik primerglödgning på olika ställen i DNA-sekvensen.

Figur 01: PCR-primerer

Guanin och Cytosin (GC) innehåll i en bra primer bör ligga i intervallet 40-60. Primerglödgningstemperaturen och smältemperaturen är viktiga faktorer under PCR. Smältemperaturen bör beräknas exakt och primerglödgningstemperaturen ska vara 5 ⁰C mindre än smälttemperaturen. Smälttemperaturen bör vara 60 ° C och 75 ° C. För höga eller för låga temperaturer resulterar i mindre aktiv DNA-polymerasaktivitet.

Vad är Sequencing Primers?

Sekvenseringsprimrar används i sammanhanget med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikt att avslöja sin specifika identitet. För att få bra sekvenseringsresultat är högkvalitativa primers och mallar viktiga. Således, när primers väljs, bör de vara unika för en viss region där vi vill sekvensera. Det bör också vara med en korrekt orientering där sekvenserna vanligtvis genereras från primers 3'-5'-ändar. Sekvensen bör sakna oönskad självhybridisering, såsom bildandet av hårnålslingor. Det bör inte innehålla konsekutiv bildning av guaninbaser.

Smältningstemperaturen (Tm) hos primern måste vara lämplig för sekvenseringsbetingelserna. Därför borde den ligga mellan 52^oC och 74^oC. Framställning av oligonukleotider som skall användas som en primer bör renas för att erhålla den önskade full längden av sekvensen. Om oligonukleotiderna innehåller orenheter kommer primersekvenssignaleringen att läggas över från olika primingställen, och det kommer även att minska antalet basceller.

Figur 02: Sequencing Primers

Primersmältningstemperaturen (Tm) hos en oligonukleotid bestämmer hur starkt de komplementära DNA-strängarna hybridiseras med varandra. Tm kan betraktas som en termodynamisk beräkning där den är beroende av både DNA-sekvenser och flera betingelser, såsom saltkoncentration. Tm är viktigt under PCR där en variant som kallas cykelsekvenseringen används för att producera en grupp av dideoxynukleotid-terminerade fragment. Här blir primern som sekvenseras initialt annealed alternativt, sedan förlängd och slutligen denaturerad för amplifiering. Därför bör Tm-värdet vara mellan 52^oC och 74^o C. Syntetiserade oligonukleotider kan erhållas från DNA / RNA-synteslaboratorier enligt val. Den lilla skalan av syntes som används för DNA-sekvensering är vanligen 50 nmol. Också viktigast bör de primers som används för sekvensering renas för att vara fria från föroreningar som förhindrar kvalitetsreduktion.

Vad är likheterna mellan PCR-primer och sekvenseringsprimrar?

• Både PCR-primrar och sekvenseringsprimrar är primers som används i amplifieringsprocessen för en riktade DNA-sekvens.
• Både PCR-primer och sekvenseringsprimrar är sammansatta av nukleotider.
• Både PCR-primer och sekvenseringsprimrar är korta oligomerer.

Vad är skillnaden mellan PCR-primer och sekvenseringsprimrar?

PCR Primers vs Sequencing Primers
PCR-primrar är korta DNA-strängar med en nukleotidsekvenslängd av 18-25 vilket gör dem kompatibla med start- och ändregionen hos DNA-fragmenten som skall amplifieras.	Sekvenseringsprimrar är korta oligomerer som används i samband med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikt att avslöja sin specifika identitet.
Fungera
PCR-primrar används för amplifiering av en särskild DNA-sekvens.	Sekvenseringsprimrar används i sammanhanget med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikt att avslöja sin specifika identitet.
Antal primrar som behövs
Två primers; en framåtriktare och en omvänd primer används som PCR-primers.	Behöver bara en primer som sekvenseringsprimer.

Sammanfattning - PCR Primers vs Sequencing primers

Sekvenseringsprimrar används i sammanhanget med sekvensering av ett DNA-fragment med avsikt att avslöja sin specifika identitet. En sekvenseringsprimer kommer att räcka för att driva processen. För att få bra sekvenseringsresultat är högkvalitativa primers och mallar viktiga. Således, när primers väljs, bör de vara unika för en viss region där vi vill sekvensera. PCR-primerer är korta DNA-strängar med en nukleotidlängd av 18-25 vilken är kompatibel med start- och ändregionen hos DNA-fragmenten som skall amplifieras. PCR-primers kan vara en framåtriktad primer och omvänd primer. Guanin och Cytosin (GC) innehåll i en bra primer bör ligga i intervallet 40-60. Primerglödgningstemperaturen och smälttemperaturen är viktiga aspekter under PCR. Detta är skillnaden mellan PCR-primers och sekvenseringsprimrar.

Referens:

1. "Polymeraskedjereaktion (PCR)." Khan Academy. Tillgänglig här
2. "Sequencing primers och primer design." Sequencing primers och primer design | University Core DNA Services | University of Calgary. Tillgänglig här    

Image Courtesy:

1.Primers RevComp'By Zephyris - eget arbete, (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 
2.DNA Sequencin 3 märkningsmetoder "Abizar (original uppladdare) på engelska Wikipedia - Överförd av Gustavocarra., (Public Domain) via Commons Wikimedia