Skillnad mellan PCR och QPCR

Huvudskillnad - PCR vs QPCR

PCR (polymeraskedjereaktion) och qPCR (kvantitativ PCR) är två tekniker som används i bioteknik för att amplifiera DNA för olika ändamål. PCR är en relativt enkel teknik. qPCR är också känd som realtids-PCR eller digital PCR. De huvudskillnad mellan PCR och qPCR är det PCR är en kvalitativ teknik medan qPCR är en kvantitativ teknik. Med PCR kan du läsa resultatet som "närvaro eller frånvaro". Men i qPCR kvantifieras mängden DNA amplifierad i varje cykel. Om RNA används i PCR är tekniken känd som RT-PCR (omvänd transkriptions-PCR), och om RNA används i qPCR är tekniken känd som qRT-PC.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är PCR
     - Definition, Processer, Användningar
2. Vad är QPCR
     - Definition, Processer, Användningar
3. Vad är likheterna mellan PCR och QPCR
     - Översikt över gemensamma funktioner
4. Vad är skillnaden mellan PCR och QPCR
     - Jämförelse av viktiga skillnader

Nyckelord: agarosgelelektrofores, ampliconer, DNA-polymeras, fluorescerande färgämne, PCR, prober, qPCR, RT-qPCR

Vad är PCR

PCR avser en teknik i bioteknik som tillåter analys av en kort sekvens av DNA genom att amplifiera ett valt segment av DNA. Det är relativt känslig metod eftersom mycket små volymer krävs av en enda reaktion. Tekniken är baserad på DNA-polymeras förmåga att syntetisera nya DNA-strängar till den erbjudna mallsträngen på ett komplementärt sätt. Reaktionsblandningen av PCR är sammansatt av DNA-polymeras, DNA-nukleotider, primrar, DNA-mallen som skall amplifieras och magnesium. Amplifieringen utförs inom en termocykler. DNA-polymeras bör vara värmebeständigt eftersom höga temperaturer används i denna reaktion. De två typerna av DNA-polymeraser som används i PCR är Taq DNA-polymeras och pfu DNA-polymeras. Taq DNA-polymeras används i stor utsträckning i PCR.

DNA-polymeras kräver en befintlig DNA-sträng vid 3'-änden för att syntetisera en ny sträng. Följaktligen sättes en oligonukleotidprimer till reaktionsblandningen för initiering av DNA-syntes. Kravet på en primer i PCR möjliggör amplifiering av endast en specifik region i mallen. Målsekvensen flankeras av framåtriktat och bakåtriktat primers. I slutet av en PCR, nya kopior av en specifik DNA-sekvens, som kallas amplikoner, ackumuleras i miljarder. Komponenterna i PCR bör optimeras på ett sådant sätt att PCR-prestanda förbättras samtidigt som misslyckandet minimeras. Den vanliga PCR-reaktionen visas i Figur 1.

Figur 1: PCR

Steg av PCR

De tre stegen i en PCR beskrivs nedan.

1. denaturering - Den dubbelsträngade DNA-mallen separeras i två enkla strängar genom uppvärmning till 94-95 ° C.
2. glödgning - Framåt och bakåtprimrar binder till de komplementära sekvenserna i mallen. Temperaturen beror på smältpunkten för primerkombinationen.
3. Primerförlängning - DNA-polymerasenzym sträcker sig varje primer vid deras 3'end genom tillsats av komplementära baser till den växande strängen. Den optimala temperaturen på Taq polymeras, dvs 72 ° C, används som temperaturen i förlängningssteget. Utvidgningstiden beror på antalet baspar i mallsträngen.

De tre stegen upprepas för 28-35 gånger. Agarosgelelektrofores används vid storleksfraktionering av PCR-produkter. Produkten färgas av etidiumbromid och observeras under UV. PCR-produkten eller det amplifierade DNA kan användas vid kloning, sekventering eller genotypning.

Vad är QPCR

QPCR avser en teknik inom bioteknik som tillåter detektering, karakterisering och kvantifiering av nukleinsyror för olika tillämpningar. Därför är det en typ av kvantitativ PCR. Både DNA och RNA kan användas som qPCR. Om RNA används som mall, bör det först omvandlas transkriberas till cDNA. Således är denna typ av qPCR känd som RT-qPCR. Den traditionella PCR utförs för cDNA eller vanligt DNA-prov. I qPCR används emellertid fluorescerande färgämnen för att märka PCR-produkten i varje steg i PCR-cykeln. Detta möjliggör insamling av data som PCR utvecklas, vilket möjliggör kvantifiering av amplikonerna under exponentiell fas av PCR. Den huvudsakliga typen färgämne som används i qPCR är SYBR Green. Färgen binder till dubbelsträngad DNA. Eftersom fluorescensen ökas proportionellt med mängden amplifierat DNA kan kvantifieringen göras i "realtid". Den huvudsakliga nackdelen med användningen av färgämnet är att det medger kvantifiering av en specifik produkt i provet. Förutom färgämnen kan prober också användas i kvantifieringsprocessen. TaqMan-prober är en av huvudtyperna av oligonukleotidprober som används i qPCR, och processen med fluorescensemission visas i figur 2.

Figur 2: TaqMan Probe

Prober kan utformas på ett sådant sätt att detekterar flera PCR-produkter inom samma prov. TaqMan sond är en av huvudtyperna av hydrolysprober; införlivandet av denna sond i PCR-produkten exponerar fluoroforen, som emitterar fluorescensen. Fluorescerande färgämnen är mer specifika för PCR-produkten. Följaktligen används de i de flesta diagnostiska analyser för att detektera PCR-produkten. 

Likheter mellan PCR och QPCR

• PCR och qPCR är två typer av tekniker som används i bioteknik för att amplifiera DNA för olika ändamål.
• Den traditionella polymeraskedjereaktionen utförs som kärntekniken i både PCR och qPCR.
• RNA kan användas i både PCR och qPCR genom att använda omvänd transkription som den första reaktionen.

Skillnad mellan PCR och QPCR

Definition

PCR: PCR är en teknik inom bioteknik som möjliggör analys av en kort DNA-sekvens genom att amplifiera ett valt segment av DNA.

QPCR: QPCR är en teknik inom bioteknik som möjliggör detektering, karakterisering och kvantifiering av nukleinsyror för olika tillämpningar.

Kvantitativ kvalitativ

PCR: PCR är kvalitativ teknik.

QPCR: QPCR är en kvantitativ teknik.

Detektion av produkten

PCR: Produkten detekteras av agarosgelelektroforesen i PCR.

QPCR: Produkten kan detekteras i varje amplifieringscykel i qPCR.

Insamling av data

PCR: Uppgifterna samlas i slutet av reaktionen i PCR.

QPCR: Data samlas in under exponentiell fas av reaktionen i qPCR.

Upplösning

PCR: PCR har en mycket dålig upplösning.

QPCR: QPCR har en mycket hög upplösning.

färgämnen

PCR: PCR använder etidiumbromid för att fläcka produkten under PCR.

QPCR: QPCR använder fluorescerande färgämnen för att detektera produkten.

Tid

PCR: PCR är en mer tidskrävande metod.

QPCR: QPCR är mindre tidskrävande.

RNA

PCR: RT-PCR är typen av PCR som använder RNA som mall.

QPCR: RT-qPCR är typen av qPCR som använder RNA som mall.

Roll

PCR: PCR används för att detektera närvaron eller frånvaron av vissa genomfragment.

QPCR: QPCR används för att kvantifiera ett visst fragment i ett prov.

Slutsats

PCR och qPCR är två typer av tekniker som används i bioteknik för att amplifiera DNA för olika ändamål. PCR är den traditionella amplifieringsmetoden som används för att identifiera närvaron eller frånvaron av ett DNA-fragment. QPCR används för att kvantifiera ett visst fragment i ett prov. Således är PCR en kvalitativ teknik medan qPCR är en kvantitativ teknik. Detta är den största skillnaden mellan PCR och qPCR.

Referens:

1. "QPCR vs Digital PCR vs Traditionell PCR." Thermo Fisher Scientific, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "PCR" av Madprime - eget arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Taqman" Av användaren: Braindamaged - Egent arbete av den ursprungliga uppladdaren (Public Domain) via Commons Wikimedia