Skillnad mellan PCR och DNA-sekvensering

Huvudskillnad - PCR vs DNA-sekvensering
 

PCR- och DNA-sekvensering är två viktiga tekniker inom molekylärbiologi. Polymeraskedjereaktion (PCR) är processen som skapar ett stort antal kopior av ett DNA-fragment. DNA-sekvensering är tekniken som resulterar i den exakta ordningen av nukleotiderna i ett givet DNA-fragment. Detta är nyckelfaktorn mellan PCR och DNA-sekvensering. PCR är ett av de viktigaste stegen som är involverade i DNA-sekvensering.

INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är PCR
3. Vad är DNA-sekvensering
4. Side vid sida-jämförelse - PCR vs DNA-sekvensering
5. Sammanfattning

Vad är PCR?

Polymeraskedjereaktion (PCR) är en DNA-amplifieringsteknik som används i molekylärbiologi. Det producerar tusentals miljoner exemplar av ett visst DNA-fragment. Denna metod utvecklades av Kary Mullis 1983. I denna teknik tjänar fragmentet av DNA som skall amplifieras som mallen och DNA-polymerasenzymet tillför komplementära nukleotider till primern som är tillgänglig i PCR-blandningen. Vid slutet av PCR-reaktionen syntetiseras många kopior av prov-DNA.

Det finns olika komponenter i PCR-blandningen, inklusive DNA, DNA-polymeras (Taq-polymeras), primers (framåt och bakre primers), nukleotider (byggstenar av DNA) och en buffert. PCR händer inom en PCR-maskin, och den korrekta PCR-blandningen ska laddas i maskinen, och det korrekta programmet ska köras. Denna teknik möjliggör produktion av tusentals miljoner exemplar av en viss del av DNA från en mycket liten mängd DNA.

PCR-reaktioner uppträder på ett cykliskt sätt för att producera den synliga mängden PCR-produkter på en gel. Det finns tre huvudsteg som är involverade i en PCR-reaktion, nämligen denaturering, primerglödgning och strängförlängning såsom visas i Figur 01. Dessa tre steg förekommer vid tre olika temperaturer. DNA existerar i dubbelsträngad form av vätebindningar mellan komplementära baser. Före implikation bör dubbelsträngat DNA separeras från varandra. Det görs genom att ge en hög temperatur. Vid hög temperatur denatureras dubbelsträngat DNA i enstaka strängar. Primerna bör då närma sig de flankerande ändarna av det specifika fragmentet eller DNA-genen. Primer är en kort bit av enkelsträngad DNA som är komplementär till målsekvensen. Framåtriktad och omvänd primers anneal med komplementära baser vid flankändarna hos det denaturerade prov-DNA vid glödgningstemperaturen. Primers bör vara värmebeständiga. När primers anneal med prov-DNA initierar taq-polymerasenzym syntesen av de nya strängarna genom tillsats av nukleotider som är komplementära till mål-DNA. Taq-polymeras är ett värmestabilt enzym isolerat från en termofil bakterie som kallas Thermus aquaticus. PCR-bufferten bibehåller de optimala betingelserna för taq-polymerasverkan. Dessa tre steg av PCR-reaktioner upprepas för att producera den erforderliga mängden PCR-produkt. Efter varje PCR-reaktion fördubblas antalet DNA-kopior. Därför kan en exponentiell amplifiering observeras i PCR. PCR-produkter kan observeras med gelelektrofores och kan renas för vidare studier.

Figur 01: Stora steg för en PCR-reaktion

PCR är ett värdefullt verktyg inom medicinsk och biologisk forskning. PCR har ett speciellt värde i rättsmedicin eftersom det kan förstärka DNA för studier från de små proverna från brottslingar och göra rättsmedicinska DNA-profiler. PCR används i stor utsträckning inom många områden av molekylärbiologi inklusive genotyping, genkloning, mutationsdetektering, DNA-sekvensering, DNA-mikroarrays och faderskapstest etc..

Figur 02: Polymeraskedjereaktion

Vad är DNA-sekvensering?

DNA-sekvensering är bestämningen av en exakt ordning av nukleotiderna - adenin, guanin, cytosin och tymin i ett givet DNA-fragment. Genetisk information lagras i DNA-sekvenserna med användning av nukleotidernas korrekta ordning. Därför är det väldigt viktigt att hitta den exakta ordningen av nukleotiderna i ett DNA-fragment för att veta om generens struktur och funktion.

DNA-sekvenseringsprotokoll innefattar olika processer. Det första steget är isoleringen av intresserad DNA eller genom-DNA hos en organism. Med användning av PCR (såsom beskrivits ovan), bör den önskade regionen av DNA amplifieras. Förstärkt PCR-produkt bör separeras genom gelelektroforesen och renas. Förstärkta fragment betjänas som mallar för sekvensering. Sekvensering kan utföras antingen efter Sanger-sekvensering eller hög genomströmningssekvenseringsmetod. Sanger-sekvensering kräver kapillärelektrofores av resulterande DNA-fragment. Bestämning av den korrekta nukleotidordningen kan göras genom manuell avläsning av autoradiografer eller användande av automatiserade DNA-sekvenser.

Gen-sekvensering bidrog till humant genomprojekt och underlättade kartläggningen av det humana genomet i 2003. I rättsmedicinering möjliggjorde DNA-sekvensering identifiering av individer som visar unika DNA-sekvenser och identifierar brottslingarna. I medicin kan DNA-sekvensering användas för att detektera de gener som är ansvariga för genetiska och andra sjukdomar, hitta defekter gener och ersätta dem med korrekta gener. Vid jordbruk används DNA-sekvenseringsinformation för vissa mikroorganismer för att producera transgena grödor med ekonomiskt önskade egenskaper.

Figur 03: DNA-sekvensering

Vad är skillnaden mellan PCR och DNA-sekvensering?

PCR vs DNA-sekvensering
PCR-processen skapar tusentals miljoner exemplar av det intresserade DNA-fragmentet.	DNA-sekvensering är processen att bestämma den exakta ordningen av nukleotiderna i ett givet DNA-fragment.
Resultat
PCR skapar tusentals miljoner exemplar av ett visst DNA-fragment	Detta resulterar i den korrekta ordningen av baserna i ett särskilt DNA-fragment.
Inblandning av ddNTPs
PCR kräver inte ddNTP. Det använder dNTPs.	DNA-sekvensering kräver att ddNTPs avslutar strängbildningen.

Sammanfattning - PCR vs DNA-sekvensering

PCR och DNA-sekvensering är mycket viktiga verktyg inom många områden av molekylärbiologi. Förstärkning av DNA-fragmenten görs genom PCR-tekniken medan den korrekta ordningen av nukleotiderna av ett DNA-fragment bestäms genom DNA-sekvenseringen. Detta är skillnaden mellan PCR och DNA-sekvensering.

Referens:
1. "Polymeraskedjereaktion (PCR)." National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n.d. Webb. 21 februari 2017.
2. Shendure, Jay och Hanlee Ji. "Nästa generations DNA-sekvensering." Nature News. Nature Publishing Group, 09 okt 2008. Web. 21 februari 2017

Image Courtesy:
1. "PCR-steg" Av Tinojasontran - Egent arbete (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Polymeraskedjereaktion" Av Enzoklop - eget arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "DNA-sekvens" Av Sjef - Egent arbete (Public Domain) via Commons Wikimedia