Varför används PCR i processen med DNA-sekvensering

DNA-sekvensering är en teknik som används för att bestämma nukleotidsekvensen för ett särskilt DNA-fragment. Sanger-sekvensering och nästa generations sekvensering är två typer av sekvenseringsmetoder. Fluorescerande markörer används för att identifiera varje nukleotid i sekvensen. PCR används för införlivandet av de fluorescerande markörerna i DNA-fragmentet. PCR (polymeraskedjereaktion) är en teknik som används i laboratoriet för att producera miljoner kopior av ett visst DNA-fragment. Analysen av PCR-fragmenten i gelén möjliggör bestämning av DNA-fragmentets nukleotidsekvens.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är sekvensering
     - Definition, Typer av sekvensering - Nästa generationssekvensering, Sanger-sekvensering
2. Varför används PCR i processen med DNA-sekvensering
    - Inkorporering av fluorescerande färgämnen under PCR

Nyckelvillkor: ddNTPs, dNTPs, DNA-sekvensering, fluorescerande färgämnen, nästa generationssekvensering, PCR, Sanger Sequencing

Vad är sekvensering

Sekvensering är en laboratorie teknik som används för att bestämma nukleotidsekvensen av en DNA-molekyl. Sanger-sekvensering och nästa generationens sekvensering är de två huvudsakliga metoderna för DNA-sekvensering. Båda DNA-sekvenseringsmetoderna är involverade i införlivandet av fluorescerande tillverkare i DNA-strängen genom PCR för bestämning av nukleotidsekvensen för en viss DNA-sträng.

Sångersekvensering

Den första sekvenseringsmetoden, som är känd som Sanger-sekvensering, utvecklas först av Fredric Sanger 1975. Följaktligen är den känd som Sanger-sekvensering. Sångersekvensering är involverad i selektiv inkorporering av kedjanslutande dideoxynukleotider (ddNTPS) genom DNA-polymeras under in vitro DNA-syntes. Därför är det också känt som kedjans avslutningsmetod. Vanliga deoxynukleotider (dNTPs) används för förlängning av DNA-strängen. ddNTPs tillsättes också till reaktionsblandningen för uppsägning av kedjeväxten. De fyra typerna av ddNTPs adderas till fyra separata PCR-blandningar. Därför utförs fyra separata PCR-reaktioner genom tillsats av ddATP, ddGTP, ddCTP och ddTTP. För varje reaktionsblandning avslutas en enda typ av tillsatt ddNTP (om ddATP tillsätts), tillväxten av olika amplikoner vid varje (A) nukleotid i DNA-fragmentet. Därefter separeras de fyra reaktionerna med gelelektrofores. Den emitterande fluorescensen detekteras av en fluorometer. Sanger-sekvensering används i stor utsträckning för bestämning av sekvensen av fragmenten som användes vid DNA-kloning och fragmenten amplifierades genom PCR. Det allmänna förfarandet för Sanger-sekvensering visas i Figur 1.

Figur 1: Allmän process för Sanger-sekvensering

Nästa generations sekventering

Nästa generationens sekvensering är det kollektiva namnet för de senaste DNA-sekvenseringsteknikerna. Flera sekvenseringsreaktioner utförs i mikroskop på ett chip vid en gång i nästa generations sekvensering. Båda sekvenseringsmetoderna använder märkta nukleotider med fluorescens som införlivas i amplikonen under PCR, vilket möjliggör bestämning av nukleotidsekvensen. Kedjeterminerande tillsats av fluorescerande markörer är också involverad i nästa generations sekvensering. Huvudskillnaden mellan Sanger-sekvensering och nästa generations-sekvensering är emellertid användningen av kapillärelektrofores för separation av annorlunda märkta ampliconer i nästa generations sekvensering. Kapillärelektrofores är en analytisk separationsmetod genom vilken molekylerna separeras baserat på deras elektroforetiska rörlighet.

Varför används PCR i processen med DNA-sekvensering

Under sekvensering bör fluorescerande markörer inkorporeras i DNA-strängen för bestämning av nukleotidsekvensen. Denna införlivande sker under PCR. I allmänhet införlivas de fyra typerna av dNTPs i den nyligen syntetiserande DNA-strängen under PCR. Detta fenomen används i DNA-sekvensering för att införliva fluorescerande märkta dideoxynukleotider (ddNTP) i amplikonen under bestämning av DNA-sekvensen.

I allmänhet sättes en blandning av vanliga fyra baser (dNTPs, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) till PCR-reaktionsblandningen under DNA-sekvensering.

Dessutom tillsätts en av de fyra dideoxynukleotiderna (ddNTPs, ddATP, ddGTP, ddCTP och ddTTP) som komponenter i PCR-reaktionen i en låg koncentration. Slutligen måste fyra PCR-reaktioner utföras för bestämning av den fullständiga sekvensen. 

Figur 1: En bestämd DNA-sekvens

De ddNTPs saknar 3'-OH-grupp till vilken den inkommande nukleotiden tillsättes av DNA-polymeras. Följaktligen upphör inkorporeringen av ddNTP kedjeillväxten. Sålunda sker i varje av de fyra PCR-reaktionerna vid en viss bas. Dessa ddNTPs är också införlivade med olika fluorescerande färgämnen (De ddATP är märkt med grönt färgämne; de ddGTP är märkt med gult färgämne; de ddCTP är märkt med blå, och den ddTTP är märkt med rött färgämne). Införlivandet av fluorescerande färgämnen och kedjeterminering sker under PCR. Amplikonerna körs på en gel och gelén skannas för fluorescensen med en fluorometer i den automatiska sekvensen för bestämning av nukleotidsekvensen.

Slutsats

DNA-sekvensering är en laboratorie-teknik som används för att bestämma nukleotidsekvensen för ett särskilt DNA-fragment. Sanger-sekvensering och nästa generations-sekvensering införlivar olika fluorescerande färgämnen i DNA-fragmentet för bestämning av nukleotidsekvensen under en PCR.

Referens:

1. Adams, Jill U. "DNA-sekvenseringsteknologier." Nature News, Nature Publishing Group, tillgänglig här.
2. "Sequencing DNA - Automatiserad sekvensering med fluorescerande färgämnen." JRank artiklar, tillgängliga här.

Image Courtesy:

1. "Sanger-sekvensering - allmän". Användarnamn: Fibonachi - власна робота (CC BY-SA 1.0) via Commons Wikimedia [modified] 2. "DNA-sekvens" Av Sjef - Egent arbete (Public Domain) via Commons Wikimedia