Hur man utformar primer för Site Directed Mutagenesis

Site-directed mutagenes (SDM) är en in vitro Metod för att skapa en mutation i en känd sekvens. Det utförs ofta med PCR-baserade metoder. Typiskt förändras en eller två baser i platsriktad mutagenes. Primers kan konstrueras med önskade mutationer för att införa små förändringar i nukleotidsekvensen. Primerförlängning och invers PCR kan användas för att introducera storskaliga mutationer. Detta tillvägagångssätt kan förändra aminosyrasammansättningen hos ett visst protein. Site-directed mutagenes används för att studera förändringar av aktiviteten hos proteiner. Det används också för att skapa fusionsproteiner också.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är Site-Directed Mutagenesis (SDM)
      - Definition, roll, metod
2. Hur man utformar primer för Site-Directed Mutagenesis
     - Substitutioner, raderingar, infogningar

Huvudvillkor: Raderingar, Infogningar, Mutationer, Site-Directed Mutagenese, Substitutioner, Traditionell PCR

Vad är Site-Directed Mutagenesis

Site-directed mutagenes är en molekylärbiologiteknik som används för att introducera specifika förändringar i en nukleotidsekvens av en gen. Det används för att ändra aminosyrasekvensen för ett protein, introducera eller avlägsna restriktionsställen, förstöra transkriptionsbindningsställen och skapa fusionsproteiner.

Bearbeta

Under platsriktad mutagenes introduceras mutationerna till plasmiderna med användning av primers, som består av den önskade mutationen. Hela mallen amplifieras genom PCR, som införlivar mutationen i mallen. Därefter avlägsnas modermallen från provet med användning av ett enzym, metyleringsberoende endonukleas. PCR-produkten eller nickedplasmidmolekylen med den önskade mutationen transformeras till bakterier. Plasmiderna kan isoleras från bakterierna med önskade modifieringar. Processen med platsriktad mutagenes visas i Figur 1.

Figur 1: Site-Directed Mutagenesis

Tre huvudtyper av metoder används för att introducera önskade mutationer i platsriktad mutagenes. De är traditionella PCR, primerförlängning och invers PCR. Primerförlängning och invers PCR kan användas för att introducera storskaliga nukleotidförändringar.

Traditionell PCR

Traditionell PCR kan användas för att introducera en eller två nukleotidförändringar till målsekvensen med modifierade primrar. Ändringarna kan vara nukleotidsubstitutioner, deletioner eller tillsatser. Mutationen inkorporeras i amplikonen under PCR. Följaktligen ersätts den ursprungliga sekvensen med den muterade sekvensen i primern.

Primerförlängning

Vid primerförlängning införlivas den önskade mutationen under en kapslad PCR. Här flankeras målsekvensen av två primrar. Den önskade mutationen inkorporeras i den inre primern och mutationen introduceras i den andra PCR-rundan. I allmänhet minskar specificiteten av en PCR-reaktion med det ökade antalet osammanfallna nukleotider i primrarna. Långa inre primers med storskaliga mutationer kan emellertid användas vid primerförlängning, eftersom nestad PCR kan öka specificiteten av PCR-reaktionen.

Inverse PCR

Inverse PCR är en metod för att amplifiera okända DNA-fragment genom att utforma primrar till en känd DNA-sekvens. Det kan användas för att ersätta, ta bort eller infoga nukleotider i stor skala.

Tillämpningarna av plats-styrd mutagenes beskrives nedan.

1. Att studera proteins struktur, funktion och katalytiska egenskaper
2. För att förbättra proteinernas egenskaper (proteinteknik)
3. Att introducera eller avlägsna restriktionsendonukleasställen.

Hur man utformar primer för Site-Directed Mutagenesis

Site-directed mutagenes är en process för att introducera den önskade mutationen med hjälp av en primer. Mutationen kan vara en substitution, införing eller deletion. Eftersom specificiteten av PCR minskar med de ökande osammanfallna nukleotiderna i primern kan traditionell PCR endast introducera ett eller två basparförändringar till målsekvensen. Andra metoder såsom primerförlängning och invers PCR kan användas för att introducera storskaliga mutationer. Primer-designen i platsriktad mutagenes visas i figur 2.

Figur 2: Primers för Site-Directed Mutagenesis

Utbyte

För substitutioner bör en av de två primrarna innehålla den önskade mutationen i mitten av primern. Här, den sida som innehåller mutationen inte annealerar mot målsekvensen eftersom den bildar en distorsion.

Radering

För radering kan den sekvens som ska raderas från målet försummas under primerkonstruktionen. Eftersom denna sekvens är belägen förutom den flankerade regionen med primers, skulle den inte amplifieras under PCR.

Införande

För insättningar är sekvensen som skall adderas entrasslad till 5'-änden av en av primrarna under primerdesignen. Därför kan den insatta sekvensen förbli fäst vid amplikonen också.

Slutsats

Site-directed mutagenesis är en teknik som används för att introducera mutationer i en DNA-sekvens. Dessa mutationer kan vara substitutioner, insertioner eller deletioner. Småskaliga mutationer kan introduceras i den traditionella PCR. Stora mutationer kan introduceras i primerförlängning eller invers PCR. Introduktionen av mutationen görs genom införlivande av den önskade mutationen till primern. 

Referens:

1. "Metoder för plats-riktade mutagenes". INTEGRERAD DNA-TEKNIK, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "Site Directed Mutagenesis" Av Knbusby - Egent arbete (Public Domain) via Commons Wikimedia