Hur man utformar primer för QPCR

Kvantitativ eller realtids-PCR används som en rutinanalys för övervakning av de relativa förändringarna i genuttryck under olika experimentella förhållanden. Utformning av primers samt prober under QPCR är en av de mest avgörande faktorerna som påverkar analysens kvalitet och framgång. Flera riktlinjer är tillämpliga för utformningen av primers för QPCR: GC-innehållet i primers bör vara 35-65%; smältemperaturen hos primrarna bör ligga inom 60-68 ° C; man bör också undvika sekundära strukturer, upprepningar av Gs eller Cs som är längre än 3 baser och bildandet av primerdimerer.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är QPCR
      - Definition, Process, Användning
2. Hur man utformar primer för QPCR
     - Riktlinjer för Primer Design för QPCR

Viktiga termer: Fluorescerande färgämnen, GC-innehåll, smältningstemperatur, primerer, kvantitativ PCR (QPCR)

Vad är QPCR

QPCR är en typ av PCR som tillåter kvantifiering av produkten i realtid. Fluorescerande färgämnen kan användas vid kvantifiering av PCR-produkter genom att märka dem i varje steg. Två metoder för fluorescerande märkning kan användas vid QPCR-analyser. De är användningen av fluorescerande färgämnen och de fluorescensmärkta proberna. Fluorescerande färgämnen binder till PCR-produkten medan probes annealerar med PCR-produkten för att bilda ett stabilt triplex-DNA. Det allmänt använda fluorescerande färgämnet i QPCCR är SYBR Green medan sonderna kan vara Taqman. Användningen av prober vid detektering av PCR-produkter under QPCR ger mer exakta resultat och ökar analysens känslighet.

Figur 1: Mekanism för QPCR

Hur man utformar primer för QPCR

Utformningen av primers för QPCR är avgörande för att öka pålitligheten, noggrannheten och analysens känslighet. Riktlinjer för utformningen av QPCR-primers beskrivs nedan.

1. PCR-produkt / Amplicon-storlek - PCR-produktens storlek ska vara 50-210 baspar i storlek.
2. Primerlängd - Primernas längd bör vara 19-23 nukleotider.
3. GC-innehåll - GC-innehållet i primrar bör vara 35-65%.
4. Smälttemperaturen (Tm) - Smältpunkten för primrarna bör vara 60-68 ° C. Glödgningstemperaturen för analysen är 5 ° C mindre än primerns Tm.
5. Exon-exon-korsning - När amplifierar cDNA med QPCR, bör primrarna sträcka sig över exon-exon-korsningen för att undvika amplifiering av kontaminerande DNA.
6. Repeter och körningar - Dinucleotidrepetitioner (TCTCTCTCTC) och upprepade nukleotider (t.ex. TAAAAAAAGC) bör undvikas.
7. 3 'Komplementaritet - Komplementära regioner i 3'-ändarna av fram- och bakre primers bör undvikas för att förhindra bildandet av primerdimerer.
8. 3 'Stabilitet - G- eller C-rester bör ingå i primerns 3'-ände för att öka stabiliteten i glödgningen.
9. GC-klämma - En eller två GC-klämmor vid 5'-änden av primern ökar specificiteten av glödgningen.
10. Specificitet - Primärernas specificitet bör kontrolleras av BLAST
11. SNPs - Primers bör inte innehålla några kända SNP (enkel nukleotidpolymorfism) variationer

Flera onlineverktyg kan användas i primerdesignen i QPCR, såsom Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank och OAT.

Figur 2: Formation av Primer-Dimers

Primers bör utformas på ett sådant sätt att man undviker bildandet av primerdimerer i QPCR. Det är kritiskt när man använder fluorescerande färgämnen för detektering av PCR-produkten eftersom dessa färgämnen också binder med primerdimererna för att ge falska positiva resultat.

Slutsats

QPCR används vid detektering och kvantifiering av PCR-produkter. Utformningen av primers är avgörande för QPCR för att öka noggrannheten i resultaten. Således är det viktigt att noggrant följa riktlinjerna vid utformning av primers för QPCR.

Referens:

1. "QPCR-analysdesign och optimering." LSR | Bio-Rad, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

 

1. "Taqman" Av användaren: Braindamaged - Egent arbete av den ursprungliga uppladdaren (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Primer dimers formation En" Av Tzachi Bar - Egent arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia