Hur man beräknar transfektionseffektivitet

Transfektionseffektivitet kan beräknas genom att räkna antalet celler transfekterade över de totala cellerna i ett visst prov. Antalet celler kan räknas med två metoder. Den vanligaste metoden är att använda lättdragbara journalister. Dessa reportrar kan vara grönt fluorescensprotein (GFP), luciferas, beta-galaktosidas, utsöndrat alkaliskt fosfatas (SEAP). Det senaste sättet att beräkna transfektionseffektivitet är att märka nukleinsyror, vilket möjliggör spårning av intracellulär leverans av dem. Vissa andra metoder såsom Western blotting, immunostaining och funktionella analyser kan också användas för att beräkna transfektionseffektivitet. Eftersom transfektionseffektivitet beror på flera experimentella parametrar är bestämningen av transfektionseffektivitet nyckeln för att bestämma påverkan av olika faktorer på transfektion.

Viktiga områden som omfattas

1. Vilka metoder används för att beräkna transfektionseffektivitet
     - Reporter Systems
2. Hur man beräknar transfektionseffektivitet
     - Cellräkning

Viktiga termer: Flödescytometri, GFP, Nucleic Acid Labeling, Reporter System, Transfektionseffektivitet

Vilka metoder används för att beräkna transfektionseffektivitet

Olika typer av metoder används för att beräkna transfektionseffektivitet.

1. Reporter Systems

- Grönt fluorescensprotein (GFP) - GFP finns naturligt i maneter. Den används för både kvalitativ och kvantitativ analys av transfekterade celler genom samtidig transfektion av GFP-genen med genen av intresse. Kvalitativ analys kan göras under ett fluorescensmikroskop. Kvantitativ analys kan göras med flödescytometri. Förutom GFP kan rött fluorescensprotein (RFP) och gult fluorescensprotein (YFP) också användas som reportrar. E coli kolonier som uttrycker fluorescerande proteiner visas i Figur 1.

Figur 1: Fluorescerande proteiner

• luciferas - Luciferas finns naturligt i eldflugor, som alstrar ljus. Luciferasanalyser är mycket känsliga och kan användas för kvantitativ analys av transfekterat DNA.
• Beta-galaktosidas - Beta-galaktosidas finns i E coli. Den används i den kvalitativa analysen som görs med X-gal och den kvantitativa analysen som görs genom kolorimetriska, fluorescerande eller kemiluminescerande metoder.
• Sekretiserat alkaliskt fosfatas (SEAP) - SEAP är en värmestabil reporter, som utsöndras från däggdjursceller när de uttrycks.

2. Nucleic Acid Labeling - Fluorescensmärkta plasmider kan användas vid transfektionen. Då kan de räknas under ett fluorescensmikroskop.

3. Western blotting, immunostaining och andra funktionella analyser

Hur man beräknar transfektionseffektivitet

Antalet celler som uppvisar reportern och antalet celler som inte uppvisar reportern kan räknas under ett mikroskop eller genom flödescytometri. Procentandelen celler som uppvisar reportern ger transfektionseffektiviteten.

Figur 2: Transfektionseffektivitet

Slutsats

Transfektionseffektivitet kan beräknas genom bestämning av antalet celler som uppvisar transfekterat DNA över det totala antalet celler i provet. Antalet celler kan beräknas under mikroskopet eller genom flödescytometri med ett reportersystem.

Referens:

1. "Åtgärda effektiviteten vid transfektion". Mirus Bio LLC, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "E. coli uttrycker fluorescerande proteiner "Av Erin Rod - Egent arbete, (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia