Varför används 16-rRNA för att identifiera bakterier

Bakterier är den mest allestädes närvarande livsformen på jorden. Biomassa av bakterier överstiger den hos växter eller djur. På grund av deras överflöd har de flesta bakteriearterna hittills inte identifierats. Den traditionella identifieringen av bakterier baseras på fenotypiska egenskaper, som inte är korrekta som genotypa metoder. Jämförelsen av 16S rRNA-sekvensen har framkommit som en mest föredragen genotypisk metod för identifiering av bakterier i deras genusnivå. Det finns flera anledningar att använda 16S rRNA som en hushållsgenetisk tillverkare, vilket kommer att förklaras närmare i detalj.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är 16S rRNA
- Definition, struktur, roll
2. Varför används 16S rRNA för att identifiera bakterier
- Inledning, skäl, metoder
3. Vad är applikationerna av 16S rRNA i mikrobiologi
- tillämpningar

Viktiga termer: Bakterier, klassificering, gensekvens, identifiering, ribosom, 16S rRNA

Vad är 16S rRNA

16S-rRNA är en komponent i den lilla subenheten av den prokaryota ribosomen. De två subenheterna av den prokaryota ribosomen är 50S stor underenhet och 30S små subenheten. De bildar 70S ribosom. Den lilla subenheten är sammansatt av 16S rRNA bunden till 21 proteiner. 16S-rRNA består av 1540 nukleotider. Den sekundära strukturen av 16S rRNA visas i Figur 1.

Figur 1: 16S rRNA

3'-änden av 16S-rRNA innehåller anti-Shine-Dalgarno-sekvensen som binder uppströms till startkodonet, AUG. Shine-Dalgarno-sekvensen är den bakteriella mRNA: s ribosomala bindningsplats. Eftersom 16S rRNA är väsentligt för bakteriens funktion, är genen som kodar för 16S rRNA högt konserverad bland bakteriearter. Sekvensen för 16S rRNA används allmänt vid identifiering och klassificering av bakterier.

Varför används 16S rRNA för att identifiera bakterier

De traditionella identifieringsmetoderna för bakterier baseras huvudsakligen på bakteriens fenotypiska egenskaper. Jämförelsen av 16S rRNA-sekvensen har emellertid blivit en "guldstandard", som ersätter de traditionella metoderna för bakteriell identifiering. Analysen av 16S rRNA-sekvensen är bättre för identifieringen av fenotypiskt avvikande, dåligt beskrivna eller sällan isolerade stammar. Det är också bättre för identifiering av icke odlade bakterier och nya patogener. 16S-rRNA-genen förekommer i rRNA-operonet i bakteriegenomet. RRNA-operonen visas i figur 2.

Figur 2: rRNA Operon

16S rRNA är lämpligt att användas som en hushållsgenetisk markör på grund av flera skäl. De beskrivs nedan.

16S rRNA-genen är en ubiquitös gen i bakteriegenomet. Eftersom 16S-rRNA-funktionen är väsentlig för bakteriecellen under översättning, består nästan alla bakteriegenomer av 16S-rRNA-genen.
Sekvensen av 16S rRNA-genen är starkt konserverad. Eftersom funktionen av 16S-rRNA är mer generell är sekvensen av 16S-rRNA-genen starkt konserverad. Förändringarna i gensekvensen kan betraktas som en mätning av tid (evolution).
Storleken på 16S rRNA-genen (1, 550 bp) är tillräcklig för bioinformatikändamål.
16S rRNA-genen är en väl studerad gen i bakteriegenomet. Eftersom funktionen hos 16S rRNA-genen är vital för cellen utsätts den för många studier.

Identifiering

Uppdaterat har över 8, 168 bakteriearter identifierats med användning av 16S rRNA-gensekvensen. Proceduren för identifieringsprocessen beskrivs nedan.

Extraktion av genomiskt DNA
PCR-amplifiering av 16S-rRNA-genen
Hämta nukleotidsekvensen för den amplifierade 16S-rRNA-genen
Jämför sekvensen med de befintliga nukleotidsekvenserna i databaserna

16S-rRNA-sekvensen är ca 1, 550 baspar lång och består av både variabla och konserverade regioner. De universella primrarna, som är komplementära till den konserverade regionen av genen, kan användas för amplifiering av den variabla regionen av genen genom PCR. I allmänhet amplifieras 540 basparregionen från genens början eller hela genen genom PCR. PCR-fragmentet sekvenseras och sekvensen jämförs med de existerande nukleotidsekvenserna av 16S rRNA-genen för identifiering av de förisolerade bakterieartema. GenBank, det största förvaret för nukleotidsekvenser, har över 20 miljoner sekvenser av 90, 000 olika 16S rRNA-gener. Om bakteriearterna är nya kommer inte sekvensen att matcha med någon 16S-rRNA-sekvens i databaserna.

Klassificering

Eftersom 16S-rRNA-gensekvensen finns i nästan alla bakteriearter kan jämförelsen av olika 16S-rRNA-gensekvenser användas för att differentiera bakterier upp till arter och underarter. Liknande bakteriearter kan ha liknande sekvenser av 16S rRNA-genen. Ett fylogenetiskt träd av bakterier konstruerade genom att jämföra 16S-rRNA-gensekvensen visas i figur 3.

Figur 3: Phylogenetisk Trä Konstruerad Baserat på 16S-rRNA-sekvensjämförelse

Vad är applikationerna av 16S rRNA i mikrobiologi

Applikationerna av 16S rRNA i mikrobiologi anges nedan.

16S rRNA-gensekvensering används som "guldstandard" för identifiering och taxonomisk klassificering av bakteriearter.
Jämförelse av 16S rRNA-sekvensen kan användas för igenkänning av nya patogener.
16S-rRNA-sekvenseringen kan användas som ett snabbt och billigt alternativ till fenotypiska metoder för bakteriell identifiering i medicinsk mikrobiologi.

Slutsats

16S rRNA är avgörande för bakteriens funktion, eftersom det ger en plats för bindning av bakteriell mRNA till ribosomen under översättning. Eftersom funktionen hos 16SrRNA är väsentlig för cellen är dess gensekvens närvarande i nästan alla bakterieceller. Dessutom är dess sekvens mycket konserverad. 16S-rRNA-sekvensen är emellertid också sammansatt av olika regioner, vilket möjliggör identifiering av bakteriearter. Dessutom kan bakteriearter klassificeras baserat på gensekvensen av 16S rRNA.

Referens:

1. Janda, J. Michael och Sharon L. Abbott. "16S rRNA-gensekvensering för bakteriell identifikation i diagnostiklaboratoriet: Plusser, faror och fallgropar." Journal of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, september 2007, Tillgänglig här.
2. Clarridge, Jill E. "Påverkan av 16S rRNA-gensekvensanalys för identifiering av bakterier på klinisk mikrobiologi och infektionssjukdomar." Klinisk mikrobiologi, amerikanska samhället för mikrobiologi, okt 2004, tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "16S" Av Squidonius - Egent arbete (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Amit Yadav Phytoplasma rRNA operon" (CC BY-SA 3.0) via Wikimedia Commons
3. "Phylogenetic position of Mollicutes among bacteria" Av Kenro Oshima, Kensaku Maejima och Shigetou Namba - Front. Microbiol., 14 augusti 2013 / doi: 10.3389 / fmicb.2013.00230 (CC BY 3.0) via Wikimedia Commons

Vetenskap