Vad är skillnaden mellan direkt och indirekt ELISA

De huvudskillnad mellan direkt och indirekt ELISA är det i direkt ELISA, är den primära antikroppen direkt konjugerad till detekteringsenzymet medan i sekundär ELISA en sekundär antikropp som är komplementär till den primära antikroppen konjugeras med detekteringsenzymet. Detta innebär att direkt ELISA använder en enda antikropp medan indirekt ELISA använder två antikroppar.

Direkt och indirekt ELISA är två metoder för ELISA (enzymbunden immunosorbant analys) som används för att detektera närvaron av ett specifikt antigen eller antikropp i mediet.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är Direct ELISA
     - Definition, Förfarande, Egenskaper
2. Vad är indirekt ELISA
     - Definition, Förfarande, Egenskaper
3. Vad är likheterna mellan direkt och indirekt ELISA
     - Översikt över gemensamma funktioner
4. Vad är skillnaden mellan direkt och indirekt ELISA
     - Jämförelse av viktiga skillnader

Nyckelbegrepp

Direkt ELISA, detektionsenzym, indirekt ELISA, primärantikropp, sekundärt antikropp, substrat

Vad är Direct ELISA

Direkt ELISA är en metod för ELISA som tillåter detektering av antigenet med en enzymbunden primär antikropp i sig. Denna ELISA-metod utvecklades först Perlmann och Engvall. Det anses vara den enklaste formen av ELISA. Stegen för direkt ELISA anges nedan:

1. Beläggning av plattans yta med provet;
2. Inkubation av plattan med den enzym-konjugerade, primära antikroppen;
3. Tvättning för avlägsnande av obundna antikroppar från plattan;
4. Tillsats av substratet som erfordras av den enzymatiska reaktionen;
5. Detektering av signalerna som produceras från plattan.

Här är de två huvudtyperna av enzymer som är konjugerade med den primära antikroppen HRP (pepparrotperoxidas) och alkaliskt fosfatas. De tre typerna av substrat som används tillsammans med HRP är OPD (o-fenylendiamin-dihydroklorid), TMB (3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin) och ABTS (2, 2'-azinobis [3-etylbensotiazolin-6- sulfonsyra] -diammoniumsalt). Substratet som används tillsammans med det alkaliska fosfataset är PNPP (p-nitrofenylfosfat, dinatriumsalt). Den enzymatiska reaktionen på substratet orsakar en färgförändring i mediet, vilket beror på typen av substrat och enzymet som används för reaktionen. Detta underlättar detektering av prover med målantigenet. 

Figur 1: Direkt ELISA

Direkt ELISA är mer lämplig för detektering av antigenen med hög molekylvikt i ett prov. Ju färre antal steg i denna ELISA-metod gör det en snabbare analys. På grund av kostnaden och tiden inkorporerad med märkningen av den primära antikroppen med enzymer är användningen av direkt ELISA dock ganska sällsynt. Å andra sidan ger det också negativa effekter på målantigenet.

Vad är indirekt ELISA

Indirekt ELISA är en annan metod för ELISA som använder två antikroppar för detektering: primär och sekundär antikropp. Stegen i den indirekta ELISA är följande:

1. Beläggning av plattans yta med provet;
2. Inkubation av plattan med den primära antikroppen;
3. Tvättning för att avlägsna de obundna antikropparna från plattan;
4. Inkubation av plattan med den sekundära antikroppen konjugerad med detekteringsenzymet;
5. Tvättning för att avlägsna de obundna antikropparna från plattan;
6. Tillsats av substratet som erfordras av den enzymatiska reaktionen;
7. Detektering av signalerna som produceras från plattan.

   Figur 2: Indirekt ELISA

Indirekt ELISA fortskrider genom två antikroppsbindningssteg. Å andra sidan konjugeras den sekundära antikroppen med detekteringsenzymet. I allmänhet finns det många sekundära antikroppar konjugerade med enzymer. Här är den sekundära antikroppen huvudsakligen en polyklonal anti-art antikropp. På grund av tillgängligheten av enzymkonjugerade antikroppar används den indirekta ELISA-metoden oftare i immunologiska analyser vid detektering av parasiter, bakterier och virus. Å andra sidan kan flera sekundära antikroppar vara bundna till den primära antikroppen i plattan. Därför är analysens känslighet mycket hög.

Likheter mellan direkt och indirekt ELISA

• Direkt och indirekt ELISA är två metoder för ELISA, i vilket antigenet av intresse är direkt fäst vid plattan.
• Båda metoderna involverar i detektering av närvaron av en specifik proteinmolekyl i ett prov. Denna proteinmolekyl är direkt kopplad till plattan.
• 96-brunnsplattor eller 8-bromsremsor används i båda metoderna. Båda dessa plattor och rör är uppbyggda av polystyren. Plattorna med 96 brunnar ger gott om utrymmen för bestämning av optimal utspädning för reaktionen. Under tiden är 8-brunnsremsor bättre för de finjusterade analyserna.

Skillnad mellan direkt och indirekt ELISA

Definition

Direkt Elisa avser en typ av ELISA, i vilken den primära antikroppen är konjugerad med detekteringsenzymet medan indirekt ELISA avser en typ av ELISA, i vilken den sekundära antikroppen är konjugerad med detekteringsenzymet.

Antal använda antikroppar

Direkt ELISA använder en antikropp, vilken är den primära antikroppen medan indirekt ELISA använder två antikroppar, primär och sekundär antikropp. Detta är den största skillnaden mellan direkt och indirekt ELISA.

Detection Enzyme är länkat till

Vidare är detekteringsenzymet kopplat till den primära antikroppen i direkt ELISA medan detekteringsenzymet är kopplat till den sekundära antikroppen i indirekt ELISA.

Signalintensitet

En annan skillnad mellan direkt och indirekt ELISA är att signalerna som produceras av direkt ELISA är mindre intensiva medan signalerna som produceras av indirekt ELISA är mer intensiva på grund av signalförstärkningen.

Bakgrundssignaler

Direkt ELISA producerar emellertid fler bakgrundssignaler än den indirekta ELISA.

Känslighet

Direkt ELISA är mindre känslig medan indirekt ELISA är känsligare. Detta är också en skillnad mellan direkt och indirekt ELISA. 

Korsreaktivitet

Ännu en skillnad mellan direkt och indirekt ELISA är korsreaktiviteten. Det vill säga korsreaktiviteten är minimal i direkt ELISA medan den är signifikant i indirekt ELISA.

Tid

Vidare är direkt ELISA mindre tidskrävande på grund av färre steg medan indirekt ELISA är mer tidskrävande på grund av de dubbla antikroppsbindande stegen.

Användningsfrekvens

Medan direkt ELISA är relativt sällsynt är indirekt ELISA vanligare.

Slutsats

Direkt ELISA använder endast den primära antikroppen för detektering av ett specifikt antigen. Detta innebär att den primära antikroppen är konjugerad med detekteringsenzymet i direkt ELISA. Men indirekt ELISA använder en primär antikropp för att binda med antigenet medan den enzym-konjugerade sekundära antikroppen binder till den primära antikroppen. Direkt ELISA är mindre vanligt beroende på den mindre tillgängligheten av enzymkonjugerad primär antikropp. Huvudskillnaden mellan direkt och indirekt ELISA är antalet använda antikroppar.

Referens:

1. "Typ av ELISA". Bio-Rad, Bio-Rad Laboratories, tillgängligt här

Image Courtesy:

1. "ELISA-diagram" Av Cavitri - Egent arbete (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia  
2. "Indirekt ELISA" Av Cawang - Egent arbete (CC0) via Commons Wikimedia