Hur man gör primer för PCR

Primers är en väsentlig komponent i både DNA-amplifieringen in vivo och in vitro. In vivo, enzymet, DNA-polymeras kräver en primer för initiering av DNA-replikation. In vitro, primrar används mest för initiering av polymeraskedjereaktion (PCR). Vissa andra tekniker inkluderande sekvensering, kloning, ställdriktad mutagenes etc. kräver primers. Därför utformning av primers för in vitro tekniker blir ganska enkla men en utmanande process för molekylärbiologer. Därför diskuteras de grundläggande reglerna för primern för både PCR och sekvensering i denna artikel.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är en Primer
     - Definition, Typer, Roll
2. Hur arbetar Primers i en PCR
     - Egenskaper hos DNA, process av PCR
3. Hur man gör primer för PCR
     - Grundläggande regler för design av PCR-primer
4. Hur man designar en sekvenseringsprimer
    - Funktioner av Sequencing Primers

Viktiga termer: DNA-syntes, framåtriktare, längd, smälttemperatur, PCR, omvänd primer, sekvenseringsprimrar

Vad är en Primer

En primer är en kort sträng av DNA eller RNA som fungerar som utgångspunkt för DNA-syntes. De enzymer som katalyserar DNA-replikation har förmåga att tillsätta nukleotider till en existerande 3'-ände. Därför lägger primer grunden för DNA-syntes genom att tjäna som en primär. RNA-primers används inuti cellen för initiering av DNA-replikation genom DNA-polymeras. Men syntetiskt DNA-primers kan användas för amplifiering av DNA, huvudsakligen genom PCR och andra tekniker. Två typer av primers används i PCR, och de är kända som fram- och bakåtprimrar. Under PCR kan miljontals kopior av det önskade DNA-fragmentet produceras genom att flankera den specifika DNA-sekvensen i det genomiska DNA-materialet genom fram- och bakåtprimrar. Framåtriktad och omvänd primer som flankerar en viss DNA-sekvens visas i Figur 1.

Figur 1: Fram och bakåt Primers

Hur fungerar Primers i PCR

DNA är en molekyl som har två strängar som hålls ihop. Basparmönstret är komplementärt till var och en i båda strängarna. De två strängarna hålles samman av vätebindningarna mellan komplementära kvävebaser. Dessutom har varje sträng sin egen riktning. En sträng har 5'-3'-riktning medan den andra har 3'-5'-riktning. Följaktligen är de två strängarna antiparallella. Strängen med 5 'till 3' riktning är känd som sanssträngen medan strängen med 3 'till 5' riktning är känd som antisenssträngen. Varje två strängar bör syntetiseras individuellt under PCR.

De tre stegen av PCR är denaturering, glödgning och förlängning. Vid denaturering separeras de två strängarna av DNA genom att bryta vätebindningarna genom upphettning till 95 ° C. Framåtriktaren binder till känslesträngen medan den bakre primeren binder till antisenssträngen. Glödgningen av primrar sker när temperaturen sjunker från 95 ° C till 50-60 ° C. Därför kan båda strängarna syntetiseras samtidigt med hjälp av Taq polymeras. Amplifieringen av både sense och antisenssträngarna förekommer i 5'-3'-riktningen. Eftersom PCR är en exponentiell reaktion upprepas de tre stegen i 25-35 cykler. Både fram- och bakprimrar används i varje cykel för att producera omkring 2³⁵ kopior av önskat DNA-fragment. Primers roll i PCR visas i figur 2.

Figur 2: PCR

Hur man gör primer för PCR

För att amplifiera ett särskilt DNA-fragment i genomet, bör det specifika DNA-fragmentet flankeras av både framåt och bakåt-primers. Därför bör båda primrarna vara komplementära till sekvenserna som flankerar DNA-fragmentet. De grundläggande riktlinjerna för den framgångsrika utformningen av PCR-primers beskrivs nedan.

1. Riktningen för både framåt och bakre primer bör vara 5 'till 3'.
2. Längden av varje primer bör ligga mellan 18 och 25 nukleotider i längd.
3. GC-innehållet i primrarna är mellan 40 och 60% och närvaron av en C eller G i primerns 3'-ände kan främja bindning.
4. Smälttemperaturen och Tm (temperaturen vid vilken halva primern har blivit annealed till mallen) hos primerparet bör vara likartad och över 60 ° C. Maximal skillnad ska vara 5 ° C.
5. Primerns 3'-ände borde exakt matcha mall-DNA.
6. Minst 2G eller C baser (GC-klämma) ska finnas närvarande i de senaste 5 baserna vid 3'-änden av primern. GC-klämman främjar en stark bindning till målsekvensen.
7. Restriktionsställen med 5-6 nukleotider kan sättas till 5'-änden av primern.
8. Duinkleotidrepetitionerna (ATATATAT) eller upprepningar av samma nukleotid mer än 4 gånger (ACCCC) bör undvikas i primer-sekvenserna. Detta orsakar felprovning.
9. Intra-primerhomologi eller sekundära strukturer av primers bör undvikas. Inter-primerhomologi eller komplementära sekvenser i fram- och bakre primersna bör undvikas. Båda förhållandena kan bilda självdimerer eller primerdimerer.
10. ΔG-värdet för dimeranalys bör ligga mellan 0 och -9 kcal / mol.

Många onlineverktyg är tillgängliga för enkelhetens primerdesign, såsom Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar etc. Specificiteten hos de designade primrarna kan bestämmas av verktygen som NCBI Primer-BLAST eller UCSC in-silico PCR. 

Figur 3: Primer 3 gränssnitt

Hur man designar en sekvenseringsprimer

Sekvenseringsprimrar är korta, DNA-strängar, precis som PCR-primers. PCR-primrar är emellertid utformade för amplifiering av ett visst DNA-fragment medan sekvenseringsprimrar används för att avslöja nukleotidsekvensen för det amplifierade DNA-fragmentet med PCR. Till skillnad från PCR-primers kan en enda primer användas vid sekvenseringen, om endast målsekvensen är mindre än 500 bp i längd. Som ett exempel kan den främre primeren av PCR användas vid sekvensering, för att förstärka endast sanssträngen. Dessutom är graden av otillbörliga toleranser som tolereras under sekvenseringsreaktionen högre än PCR. I allmänhet är PCR-primrar komplementära till målsekvensen. Vissa sekvenseringsprimrar är emellertid inte relaterade till målsekvensen. De är kända som universella primers. Universella primers såsom T7 eller SP6 anneal mot vektorn som bär målsekvensen. De kan användas för både en mängd olika vektorer och olika typer av DNA-fragment.

Slutsats

Primers används i PCR och sekvensering för initiering av DNA-syntesen. Två typer av PCR-primers kan identifieras som fram- och bakre primer. Framåtprimrar annealerar mot känslesträngen medan omvända primers annealerar mot antisenssträngen. Vid sekvensering kan antingen framåtriktad eller omvänd primer användas för att förstärka målet. Under utformningen av primers bör många faktorer betraktas som primerlängd, Tm och GC-innehåll. Många onlineverktyg finns tillgängliga som kan användas för att utforma primers för en viss sekvens.

Referens:

1. "Primer Design: Tips för en effektiv process." Genome Compiler Corporation, 3 Nov. 2015, Tillgänglig här.
2. "Sequencing primers och primer design." Sequencing primers och primer design, University of Calgary, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "Primers RevComp" Av Zephyris - Egent arbete (CC BY-SA 3.0) via Wikimedia Commons
2. "Polymeraskedjereaktion" Av Enzoklop - Egent arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia