Hur man isolerar mRNA från Total RNA

Oligo-dT / bärarkombinationerna används huvudsakligen vid rening av mRNA från totalt RNA med en teknik som är känd som affinitetskromatografi. Det finns två huvudmetoder för att isolera mRNA från totalt RNA baserat på typen av celler; nämligen direkt metod för mRNA-isolering och minus-metod för mRNA-isolering. Båda metoderna förklaras i denna artikel.

Messenger RNA (mRNA) är en produkt av transkription, som består av en serie RNA nukleotider. Den bär information i gener från kärnan till cytoplasman för syntes av proteiner. RNA-isolering från en viss celllinje resulterar i totalt RNA, som består av rRNA och tRNA tillsammans med mRNA. Därför bör mRNA separeras från blandningen av totalt RNA under studien av transkriptomen hos cellinjen. Unika egenskaper hos mRNA såsom närvaron av en poly (A) svans vid 3'-änden av mRNA-molekylen används för separationen. Eftersom oligo-dT-molekyler är komplementära till poly (A) svansen kan mRNA isoleras från en blandning av totalt RNA.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är mRNA
- Definition, struktur, funktion
2. Vad är kompositionen för total RNA
- mRNA, rRNA, tRNA
3. Hur man isolerar mRNA från Total RNA
- Användning av Oligo-dT / bärarmolekyler

Viktiga termer: Affinitetskromatografi, Messenger RNA (mRNA), Minus Metod, Oligo dT, Poly (A) svans, Total RNA

Vad är mRNA

MRNA är ett transkript av en proteinkodande gen. Det produceras inuti kärnan i eukaryoter och bär information för framställning av ett visst protein i cytoplasman. Det översätts till en aminosyrasekvens av proteinet under översättning, assisterad av ribosomer. Det primära transkriptet som produceras genom transkription av eukaryoter kallas pre-mRNA.

Figur 1: mRNA-struktur

Under post-transkriptionella modifikationer produceras en mogen mRNA-molekyl med flera egenskaper såsom 5'-keps och poly (A) svans. Den totala mRNA för en viss organism är känd som dess transkriptom.

Vad är kompositionen för total RNA

Resultatet av RNA-isolering kallas total RNA. Den består av alla tre huvudtyper av RNA som produceras av en cell. De är mRNA, tRNA och rRNA. Både tRNA och rRNA-hjälp i översättning. Storleken på eukaryot mRNA är 0,5-20 kb. Överförings-RNA (tRNA) ger motsvarande aminosyror under översättning. Det är 76-90 baspar lång och består av antikodonregion, som är komplementär till ett särskilt kodon på mRNA. Ribosomalt RNA (rRNA) är en komponent av ribosomer. Några av de mänskliga rRNA är 5 kb långa.

Över 90% av det totala RNA är sammansatt av tRNA och rRNA. Endast 1-5% av totalt RNA är mRNA. En typisk däggdjurscell kan bestå av cirka 500 000 mRNA-molekyler per cell. Mängden av en viss typ av mRNA kan vara 15-20 000 exemplar per cell.

Hur man isolerar mRNA från Total RNA

Ett antal molekylärbiologitekniker, såsom konstruktion av cDNA-bibliotek, provberedning för mikroarrayberedning, Northern blot-analys för svagt uttryckta gener etc. kräver högkvalitativ mRNA. Det finns två huvudmetoder för att isolera mRNA från totalt RNA baserat på typen av celler: Direkt metod för mRNA-isolering och minus-metod för mRNA-isolering.

Direkt metod för mRNA-isolering

Principen för separation av moget mRNA från eukaryotiskt totalt RNA involverar affinitetsselektion / affinitetskromatografi av polyadenylerat mRNA med användning av oligo dT (oligodeoxymidylat), vilket är komplementärt till poly (A) svansen. Det görs möjligt genom frånvaro av en poly (A) svans i de två andra typerna av RNA: tRNA och rRNA.

mRNA består av 30-200 adeninukleotider i sin poly (A) svans. Affinitetskolonner fyllda med oligo dT / bärarkombination används i isoleringen av mRNA från totalt RNA. Oligo dT / bärarkombinationen kan vara antingen cellulosabundet oligo dT, biotinylerad oligo dT med streptavidinkopplade magnetiska pärlor eller oligo dT-kopplade polystyren-latexpärlor. Alla försöksförhållanden bör vara i RNase-fritt tillstånd för att förhindra enzymatisk nedbrytning av RNA.

Figur 2: Affinitetskromatografi

Total RNA bör lösas i en hög saltbuffert och upphettas kort till 65-70 ° C för att störa sekundära strukturer av RNA. Villkoren för isoleringen av RNA varierar bland kommersiellt tillgängliga kit för mRNA-isolering. Preparat av poly (A) -RNA eller mRNA består emellertid av tre steg.

Hybridisering av poly (A) -RNA till oligo dT-molekyler kopplade till en bärare
Tvättning av obundet RNA
Eluering av poly (A) -RNA från oligo-dT / bärarkombination under låga stringensbetingelser

Minus Metod för mRNA-isolering

Oligo dT-baserad rening av mRNA ger endast mRNA med en poly (A) svans eller moget eukaryot mRNA. Således kan en annan metod som kallas minusmetod användas vid rening av mRNA som inte har en poly (A) svans. Denna metod kan användas vid isolering av mRNA från jäst och bakteriellt totalt RNA. Det kan också användas vid isolering av omogen typ av mRNA tillsammans med det mogna mRNA från eukaryota celler. Det involverar transkriptomberikningen genom att tömma stort ribosomalt RNA från totalt RNA. RiboMinus^TM Transcriptome Isolation kit från ThermoFisher Scientific använder tre steg i effektiv rening av mRNA från jäst och bakteriellt totalt RNA.

Hybridisering av totalt RNA med rRNA-sekvensspecifika, 5'-biotin-märkta oligonukleotidprober
Avlägsnande av rRNA / 5'-biotin-märkt probkomplex tillsammans med streptavidin-belagda magnetiska pärlor
Rening av föroreningar och eluering av mRNA.

Slutsats

Total RNA är sammansatt av de tre huvudtyperna av RNA: mRNA, rRNA och tRNA. Rening av mRNA från totalt RNA är väsentligt för analysen av transkriptomen hos en viss organism. Metoderna för rening baseras på typen av mRNA. Eukaryot mRNA, som innehåller en poly (A) svans, kan isoleras genom affinitetskromatografi med oligo dT. Omogent eukaryot mRNA och mRNA från jäst- och bakterieceller kan isoleras genom att depletera stort rRNA från totalt RNA.

Referens:

1. "mRNA-extraktion". Thermo Fisher Scientific, tillgänglig här.
2. "RNA-extraktion med RNA-typ." Thermo Fisher Scientific, tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "Äldre mRNA" (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Affinity" av Jamit på engelska Wikibooks - Överförd från en.wikibooks till Commons av Adrignola med CommonsHelper (Public Domain) via Commons Wikimedia

Vetenskap