Hur fungerar Southern Blotting

Southern blotting är en teknik som används för detektering av specifikt DNA-fragment i ett prov. Blotttekniken involverar separation av DNA-fragment baserat på storlek via gelelektrofores, överföring av det storleksfraktionerade DNA-provet på ett filtermembran, hybridisering av de specifika DNA-fragmenten med en märkt sekvensspecifik sond och detektering av de märkta banden.

Förutom identifieringen av specifikt DNA i ett prov kan storleken och överflödet hos en viss typ av DNA också bestämmas genom Southern blotting. Processen som är inblandad i Southern Blotting beskrivs i denna artikel.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är Southern Blotting
     - Definition, princip, tillämpningar
2. Hur fungerar Southern Blotting
     - Process av Southern Blotting

Nyckelvillkor: DNA, Gelelektrofores, Hybridiseringsprobe, Nylon Membran, Restriktions Digestion, Southern Blotting

Vad är Southern Blotting

Southern blotting är en hybridiseringsteknik som används vid identifieringen av specifikt DNA i ett prov. Tekniken utvecklades först av Edward M. Southern 1975. Denna process identifierar DNA-sekvenser, storlek och överflöd av en viss DNA-sekvens inom ett prov.

Ett Southern Blotting Membran visas i Figur 1.

Figur 1: Southern Blotting Membrane

Tillämpningar av Southern Blotting

Tillämpningar av Southern blotting beskrivs nedan.

1. Att detektera ett visst DNA-fragment
2. Att isolera ett särskilt DNA-fragment
3. Att identifiera mutationer och genomläggningar
4. I RFLP-analyser (polymorfism med begränsningsfragmentlängd)
5. Att identifiera genetiska sjukdomar
6. Att identifiera smittsamma ämnen
7. Faderskapstestning
8. I DNA-fingeravtryck för att identifiera brottslingar

Hur fungerar Southern Blotting

Southern blotting innefattar separation av DNA-fragment baserat på storlek via gelelektrofores, överföring av dem till ett membran, hybridisering av dem med en märkt sekvensspecifik sond och detektering av de märkta banden. Stegen i Southern Blotting beskrivs nedan.

1. DNA-digestion - DNA-provet digereras genom restriktionsenzymer för erhållande av DNA-fragment, och dessa fragment amplifieras genom PCR.
2. Gelelektrofores - DNA-fragment är storleksfraktionerad genom gelelektrofores.
3. denaturering - Gelén med fraktionerat DNA blötlägges i NaOH eller HCl för att denaturera dubbelsträngad DNA.
4. läsk - DNA-fragment i gelén överförs till ett positivt laddat nylonmembran genom en process som kallas blotting.
5. Bakning och blockering - Blottpapperet med DNA-fragment bakas för att fixera DNA på membranet. Därefter mättas de obebodda bindningsställena genom behandling med bovint serumalbumin (BSA) eller kasein.
6. Hybridisering med märkta prober - DNA-bunden membran behandlas med en märkt sond som innehåller komplementär nukleotidsekvens till det intresserade DNA-fragmentet. Hybridiseringsprober är i allmänhet 100-500 bp långa och de är märkta med radioaktiva nukleotider.
7. Visualisering genom autoradiogram - Det sondbundna membranet visualiseras under autoradiogram för att erhålla mönstren för det intresserade DNA-fragmentet.

Figur 2: Southern Blotting

Hela processen med Southern Blotting visas i figur 2.

Slutsats

Southern blotting är en hybridiseringsteknik som används vid identifieringen av specifika DNA-sekvenser från ett prov. I denna process fraktioneras DNA-provet med restriktionsenzymer, och blandningen körs på en gel. Därefter överförs bandningsmönstret i gelén till ett nylonmembran och hybridiseras med en märkt sond, vilket medger detektering av det intresserade fragmentet.

Referens:

1. "Southern Blotting." Thermo Fisher Scientific, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "Southern blot membran" Av Bojan Žunar - Egent arbete (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Figur 17 01 05" Genom CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia