Hur fungerar Illumina Sequencing Work

Illumina-sekvensering är en nästa generations sekvenseringsmetod, som även kallas "sekvensering-genom-syntes"Metod. Illumina-sekvensering är inblandad i behandling av miljontals fragment parallellt. De fyra grundläggande stegen som är involverade i Illuminas sekvenserings arbetsflöde är bibliotekspreparation, gruppgenerering, sekvensering och dataanalys, vilka beskrivs vidare i denna artikel.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är Illumina Sequencing
     - Definition, fakta, fördelar
2. Hur fungerar Illumina Sequencing Work
     - Process av Illumina-sekvensering:
          - Bibliotekets förberedelse
          - Cluster Generation
          - Sequencing
          - Dataanalys

Nyckelbegrepp: Cluster Generation, Data Analysis, Illumina Sequencing, Library Preparation, Sequencing genom Synthesis

Vad är Illumina Sequencing

Illumina-sekvensering eller sekvensering-vid-syntes (SBS) -teknologi är den mest använda nästa generationens sekvenseringsteknik i världen. Mer än 90% av världens sekvenseringsdata genereras av Illumina-sekvensering. Det var ursprungligen utvecklat av Shankar Balasubramanian och David Klenerman vid University of Cambridge. De grundade ett företag som kallades Solexa 1998. Då köpte Illumina Solexa 2007, vilket snabbt förbättrade den ursprungliga tekniken. Därför kallas också metoden Solexa / Illumina sekvenseringsmetod. Den största fördelen med Illumina-sekvensering är att den ger ett högt utbyte av felfria läsningar.

Hur fungerar Illumina Sequencing Work

De fyra stegen som är involverade i Illumina-sekvensering beskrivs nedan.

Steg 1. Biblioteksberedning

• Ett sekvenseringsbibliotek framställs genom simultan tagmentation av DNA i korta segment av 200-600 baspar genom transposaser i en process som kallas tagmentering följt av ligering av adapter i både 3'- och 5'-ändarna av de korta segmenten av DNA.
• Ytterligare motiv, såsom sekvenseringsprimerbindningsställe, index och en region, som är komplementär till flödescelloligo, adderas till adaptern på båda sidor av reducerad cykelförstärkning. Tagering och tillägg av motiv visas i Figur 1.

Figur 1: Tagmentering och tillägg av motiv

Steg 2. Klustergenerering

• Det framställda sekvenseringsbiblioteket denatureras och laddas i en flödescell för klustergenerering. Under klustergenerering är varje fragment i sekvenseringsbiblioteket isotermt amplifierat. Flödescellen består av glas som innehåller banor. Varje bana är belagd med två typer av oligonukleotider. En typ är komplementär till 5'-regionen av de ytterligare motiven och den andra typen är komplementär till 3'-regionen av de ytterligare motiven i det beredda biblioteket. Följaktligen binder dessa oligos till motsvarande regioner av DNA i sekvenseringsbiblioteket. Flödescellen med två typer av oligos visas i figur 2. Oligo som binder till sekvenseringsbibliotekets 5'-region har rosa färg medan oligon som binder till sekvenseringsbibliotekets 3'-region är grön i färg.

Figur 2: Flödescell

• När det enkelsträngade sekvenseringsbiblioteket är bunden till oligon, alstras komplementärsträngen av DNA-polymeras. Därefter denatureras det resulterande dubbelsträngade DNA och den ursprungliga strängen tvättas bort.
• De klonal amplifiering av fragmentet uppnås genom broförstärkning. Under denna process viks strängen över den andra typen av oligo på flödescellen. Sedan syntetiserar polymeras den dubbelsträngade bron. Broens denaturering resulterar i två DNA-strängar: både framåtriktad och omvänd sträng på oligos av flödescellen.
• Broförstärkning upprepas om och om igen för att samtidigt erhålla miljoner kluster av alla typer av fragment i sekvenseringsbiblioteket genom klonal amplifiering. Klonal amplifiering visas i figur 3.

Figur 3: Klonalförstärkning

• Därefter tvättas de omvända strängarna bort och behåller endast de främre strängarna på flödescellen. I framsträngen är 3'-änden fri och den är blockerad för att förhindra oönskad priming.

Steg 3. Sekvensering

Första läsning av omvänd sekvens

• Sekvensering börjar med förlängning av den första sekvenseringsprimeren. Illumina-sekvenseringsmetoden använder modifierade dNTP, vilka innehåller en terminator vid 3'-läget för deoxiribosocker. Dessa dNTPs är även fluorescensmärkta i olika färger.

• Efter tillsatsen av varje komplementär nukleotid observeras klusterna i flödescellen för emission av fluorescens.

• Efter detektion av ljus kan fluoroforen tvättas bort.

• Därefter regenereras terminatorkoncernen för sockerns 3'-position genom en hydroxylgrupp, vilket möjliggör tillsättning av en andra dNTP till växlingskedjan. Denna process är känd som sekvensering genom syntes. Sekvenserings-vid-syntesen visas i figur 4.

Figur 4: Sequencing-by-Synthesis

• Vid slutet av syntesen, den först läs av den omvända sekvensen erhålles och sekvenseringsprodukten tvättas bort.

Index 1 Läs

• Index 1-primern hybridiseras därefter till kluster för att generera en andra läs på samma sätt genom sekvensering-vid-syntes. Sekvenseringsprodukten tvättas bort.

Index 2 Läs

• 3'-änden av klustret avlägsnas sedan, vilket möjliggör hybridisering av 3'-änden med den andra typen av oligo på flödescellen (grön färg). Genom detta erhålles sekvensen för index 2-regionen. Sekvenseringsprodukten tvättas bort.

Andra läsning av framåtriktad sekvens

• Den andra typen av oligo förlängs av ett polymeras, som bildar en dubbelsträngad bro. Broen denatureras och deras 3'-ändar är blockerade. Framsträngen tvättas bort.
• De andra läs av framåtriktningen erhålles genom sekvensering-vid-syntes genom hybridisering och förlängning av den andra sekvenseringsprimeren.

Steg 4. Dataanalys

• De miljarder av läsningar som erhållits genom sekvensering grupperas baserat på deras indexsekvenser.
• Sedan sammankopplas sekvenserna med liknande läsningar.
• Framåt och bakåtläsning kopplas samman för att bilda sammanhängande sekvenser.
• De tvetydiga anpassningarna kan lösas genom parade sekvenser.
• De sammanhängande sekvenserna är inriktade mot referensgenomet för variantidentifiering.

Följande video förklarar hela processen med Illumina-sekvensering.

Slutsats

Illumina-sekvensering är en nästa generations sekvenseringsmetod. Illumina-sekvensering är involverad i framställning av ett sekvenseringsbibliotek med 200-600 baspar långa fragment av DNA. De fyra stegen som är involverade i Illumina-sekvenseringen är bibliotekspreparation, gruppgenerering, sekvensering och dataanalys. Eftersom Illumina-sekvensering ger sekvensen läsning med hög noggrannhet är det den allmänt använda sekvenseringsmetoden i världen.

Referens:

1. "Sequencing by Synthesis (SBS) Technology." Sekventeringsteknik | Sekvensering genom syntes, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "DNA-bearbetningsberedning" av DMLapato - eget arbete (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Oligonukleotidkedjor i flödescell" Av DMLapato - Egent arbete, (CC BY-SA 4.0) via Wikimedia Commons
3. "Sequencing genom syntes Reversible terminators" Av Abizar Lakdawalla (talk) - Jag skapade detta arbete helt av mig själv (CC BY-SA 3.0) via Wikimedia Commons
4. "Cluster Generation" av DMLapato - eget arbete (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia