Hur fungerar DNA-sekvensering?
Share
Sekvensering är processen involverad i bestämningen av en nukleotidsekvens av ett särskilt DNA-fragment. Under sekvensering märks DNA-fragmentet terminalt med fluorescensmärkta nukleotider genom PCR. Denna process använder fyra typer av fluorescensmärkta nukleotider, och de är dideoxynukleotider (ddNTPs). ddNTPs saknar en 3'-OH-grupp till vilken fosfatgruppen hos den inkommande nukleotiden är bunden. När en ddNTP tillsätts till odlingskedjan kommer därför ingen ytterligare tillsats av nukleotider vid kedjens 3'-ände. Det innebär att tillägget av ddNTP i odlingskedjan upphör kedjeutvecklingen. Eftersom ddNTPs tillsätts till PCR-blandningen i låga koncentrationer, avslutas varje odlingskedja vid olika nivåer. Den emitterande fluorescensen detekteras för bestämning av DNA-fragmentets nukleotidsekvens vid slutet av PCR.
Viktiga områden som omfattas
1. Vad är DNA-sekvensering
- Definition, Typer
2. Hur fungerar DNA-sekvensering?
- Process av DNA-sekvensering
Viktiga termer: Dideoxynukleotider (ddNTP), Fluorescerande markör, Gelelektrofores, Nästa generationssekvensering, Nukleotidsekvens, PCR, Sångersekvensering
Vad är DNA-sekvensering
DNA-sekvensering är en laboratorie-teknik som används vid bestämning av nukleotidsekvensen för en viss DNA-molekyl. Den använder fluorescensmärkta nukleotider, vilka införlivas under PCR. Det finns två huvudsakliga metoder för sekvensering baserad på de tekniker som används för detektering av fluorescens: Sanger-sekvensering och nästa generations sekvensering.
Sångersekvensering
Sanger-sekvensering, utvecklad av Fredric Sanger 1975, är den första utvecklade sekvenseringsmetoden. Det är också känt som kedjeavslutningsmetod eftersom det är involverat i selektiv inkorporering av kedjanslutande ddNTPs under in vitro DNA-syntes. I Sanger-sekvensering separeras amplikoner genom gelelektrofores. Sanger-sekvensering används i stor utsträckning för bestämning av sekvensen av DNA-fragmenten som användes vid kloning och fragmenten amplifierades genom PCR. En bestämd DNA-sekvens visas i Figur 1.
Figur 1: DNA-sekvensering
Nästa generationssekvensering
Den senaste DNA-sekvenseringstekniken är kollektivt känd som nästa generations sekvensering. Det är också en kedjeavslutningsmetod. Nästa generationens sekvensering använder kapillärelektrofores för separering av amplikoner med olika längder skapade genom kedjans avslutningsmetod. Nästa generationens sekvensering används vid bestämning av ett stort antal nukleotider per gång, såsom genom genom-sekvensering.
Hur fungerar DNA-sekvensering?
Under DNA-sekvensering sätts fluorescensmärkta nukleotider till ett särskilt DNA-fragment genom PCR. För förlängning av DNA-strängen används vanliga deoxinukleotider (dNTPs). Dock tillsättes ddNTPs till reaktionsblandningen, vilken är fluorescensmärkt. Eftersom ddNTPs inte har en 3'-OH-grupp i deoxyribosesockermolekylen, kan ytterligare kedjeutveckling inte uppträda, vilket avslutar kedjeväxten. Socker-fosfat-ryggrad av DNA bildas genom bildandet av fosfodiesterbindningar mellan 3'-OH-gruppen i deoxyribosocker- och fosfatgruppen hos den inkommande nukleotiden. Dock tillsätts ddNTP i låga koncentrationer; Därför avslutar de inte kedjeutvecklingen på en gång.
Fyra typer av ddNTP sätts till fyra separata PCR-blandningar. Fyra separata PCR-reaktioner utförs genom tillsats av ddATP, ddGTP, ddCTP och ddTTP. Därför termineras kedjeillväxten i respektive reaktionsblandning vid A, G, C respektive T-nukleotider. Som ett exempel, i reaktionsblandningen med tillsatt ddATP termineras tillväxten av olika amplikoner vid varje A-nukleotid i DNA-fragmentet. Bestämning av DNA-sekvens genom Sanger-sekvensering visas i figur 2.
Figur 2: Sanger-sekvensering
Var och en av de fyra typerna av nukleotider är märkta med separat fluorescensfärg; de ddATP är märkt med grönt färgämne; de ddGTP är märkt med gult färgämne; de ddCTP är märkt med blått; de ddTTP är märkt med rött färgämne. Följaktligen märks amplikonerna för de fyra PCR-reaktionerna i separata färger.
Efter amplifieringen av det intresserade DNA-fragmentet separeras amplikonerna antingen genom gelelektrofores eller kapillärelektrofores. Nukleotidsekvensen för DNA-fragmentet kan bestämmas genom detektering av den emitterande fluorescensen. Nukleotidsekvensen av 750-1000 baspar långa fragment kan enkelt bestämmas per körning genom Sanger-sekvensering. Bestämningen av nukleotidsekvensen hos ett helt genom är emellertid utmanbart tack vare ett stort antal nukleotider i genom. Men nästa generationens sekvenseringstekniker, såsom 454-sekvensering, kan cirka 20 miljoner baspar läsas per enskild körning.
Slutsats
DNA-sekvensering är en molekylärbiologiteknik som används vid bestämning av nukleotidsekvensen av DNA-fragment. Under sekvensering sätts fluorescensmärkta nukleotider till DNA-fragmenten genom PCR. Genom att detektera den emitterande fluorescensen kan nukleotidsekvensen bestämmas.
Referens:
1. "DNA-sekvensering". Khan akademin, Tillgänglig här.
Image Courtesy:
1. "DNA-sekvens" Av Sjef - Egent arbete, Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Didesoxy-Metode" Av Christoph Goemans (Modifiziert) - Dr. Norman Mauder, baserad på Datum av Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Wikimedia Commons
