Hur hjälper fluorescerande markörer att bestämma en nukleotidsekvens

DNA-sekvensering är en teknik som hjälper till att bestämma nukleotidsekvensen för en viss DNA-molekyl. De två metoderna för sekvensering är Sanger-sekvensering och nästa generations-sekvensering. Båda typerna av sekvenseringsmetoder är fullt automatiserade aktuella. Vilken DNA-sträng som helst består av de fyra nukleotiderna: adenin (A), guanin (G), cytosin (C) och tymin (T). Nukleotiderna i DNA-fragmentet märks med fyra separata fluorescerande markörer i båda typerna av sekvenseringsmetoder. De fluorescerande markörerna eller fluoroforema är molekyler som kan absorbera ljus och avge det vid en väldefinierad våglängd. De fluorescerande markörerna införlivas i DNA-strängen genom PCR. Sedan bestäms sekvensen av nukleotiderna genom automatiserade tekniker.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är sekvensering
     - Definition, Sanger-sekvensering, nästa generationssekvensering
2. Hur hjälper fluorescerande markörer att bestämma en nukleotidsekvens
     - Sekvenseringsprocedur

Viktiga termer: Dideoxynukleotider (ddNTP), Fluorescerande markör, Gelelektrofores, Nästa generationssekvensering, Nukleotidsekvens, PCR, Sångersekvensering

Vad är sekvensering

Sekvensering är en laboratorie teknik som används för att bestämma nukleotidsekvensen av en DNA-molekyl. Två huvudtyper av DNA-sekvenseringsmetoder kan identifieras som Sanger-sekvensering och nästa generations-sekvensering. Både Sanger-sekvensering och nästa generationens sekvensering använder märkta nukleotider med fluorescens för bestämning av nukleotidsekvensen.

Sångersekvensering

Sanger-sekvensering är den första utvecklade metoden för DNA-sekvensering. Metoden för sekvensering utvecklades först av Fredric Sanger 1975. Följaktligen är den känd som Sanger-sekvensering. Metoden för Sanger-sekvensering är också känd som kedjeavslutningsmetod eftersom det är involverat i selektiv inkorporering av kedjanslutande dideoxynukleotider (ddNTPS) genom DNA-polymeras under in vitro DNA-syntes. Töjningen av DNA-strängen uppnås genom de vanliga deoxinukleotiderna (dNTPs). Dock tillsättes ddNTPs till reaktionsblandningen för att avsluta kedjeillväxten. Dessa ddNTPs är fluorescerande märkta. De fyra typerna av ddNTPs adderas till fyra separata PCR-blandningar. Därför utförs fyra separata PCR-reaktioner genom tillsats av ddATP, ddGTP, ddCTP och ddTTP. I varje reaktionsblandning avslutas kedjeillväxten vid respektive A-, G-, C- och T-nukleotider. Som ett exempel, i reaktionsblandningen med tillsatt ddATP termineras tillväxten av olika amplikoner vid varje A-nukleotid i DNA-fragmentet. Därefter separeras dessa fyra reaktioner genom gelelektrofores och en fluorometer används för att söka efter den separata fluorescensen. Sanger-sekvensering används i stor utsträckning för bestämning av sekvensen av fragmenten som användes vid DNA-kloning och fragmenten amplifierades genom PCR. De bestämda nukleotidsekvenserna visas i Figur 1.

Figur 1: DNA-sekvenser

Nästa generationssekvensering

Den senaste DNA-sekvenseringstekniken är kollektivt känd som nästa generations sekvensering. Sekvenseringsreaktionerna utförs i mikroskop på ett chip samtidigt. Därför utförs flera sekvenseringsreaktioner parallellt. Vid nästa generationens sekvensering används kapillärelektrofores förutom gelelektrofores för separation av amliconer med olika längder skapade genom kedjetermineringsmetod. Kapillärelektrofores är en analytisk separationsmetod genom vilken molekyler separeras baserat på deras elektroforetiska rörlighet.

Hur hjälper fluorescerande tillverkare att bestämma en nukleotidsekvens

Under sekvensering tjänar DNA-sekvensen som mallsträng för DNA-syntes genom PCR. En DNA-primer används för initiering av DNA-syntes genom DNA-polymeras. En blandning av vanliga, fyra baser (dNTPs, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) och en låg nivå av en av de fyra dideoxynukleotiderna (ddNTPs, ddATP, ddGTP, ddCTP och ddTTP) tillsätts som komponenter i PCR-reaktionen. Följaktligen utförs fyra individuella PCR-reaktioner genom tillsats av var och en av de fyra ddNTP: erna. Dideoxynukleotider har två speciella egenskaper:

1. De saknar 3'-OH-grupp till vilken den inkommande nukleotiden tillsättes av DNA-polymeras. Följaktligen upphör inkorporeringen av ddNTP kedjeillväxten.
2. De är märkta med olika fluorescerande färgämnen: ddATP är märkt med ett grönt färgämne, de ddGTP är märkt med ett gult färgämne, de ddCTP är märkt med blå, och den ddTTP är märkt med rött färgämne.

Emellertid tillsätts kedjestoppande ddNTPs i låga koncentrationer; De avslutar inte hela PCR-processen samtidigt. Men när en av de fyra ddNTP: erna är inkorporerade i odlingskedjan, avslutas den specifika kedjeutvecklingen. Därför, i slutet av varje fyra PCR-reaktioner produceras en serie amplikoner (de resulterande DNA-fragmenten med PCR), vilka avslutas vid varje nukleotid av mål-DNA-fragmentet. Dessa ampliconer kan köras i en gel. De fluorescerande färgämnena som passerar vid en definierad punkt av den elektroforetiska gelén kan skannas av en fluorometer för att bestämma nukleotidsekvensen i de automatiserade DNA-sekvenserna. Den fluorescerande märkta nukleotidsekvensen erhållen i DNA-sekvensering visas i figur 2.

Figur 2: Fluorescerande märkt nukleotidsekvens

Genom att kombinera var och en av nukleotiderna i serien kan nukleotidsekvensen för det ursprungliga DNA-fragmentet bestämmas. Nukleotidsekvensen för ett fragment med 750-1000 baspar kan enkelt bestämmas per körning genom Sanger-sekvensering. Emellertid är sekvenseringen av ett helt genom fortfarande utmanbart tack vare närvaron av ett stort antal nukleotider. 454 sekvensering är en typ av nästa generations sekvensering genom vilken 20 miljoner baspar kan läsas per enskild körning.

Slutsats

Sekvensering är en teknik som används vid bestämning av nukleotidsekvensen för ett särskilt DNA-fragment. Sanger-sekvensering och nästa generations sekvensering är de två huvudsakliga sekvenseringsteknikerna. Båda teknologierna använder fluorescerande markörer för bestämning av nukleotidsekvensen. Var och en av de fyra kedjanslutande dideoxynukleotiderna märks med fyra olika fluorescerande färgämnen, och de används i fyra separata PCR-reaktioner för att erhålla sekvensen.

Referens:

1. Adams, Jill U. "DNA-sekvenseringsteknologier." Nature News, Nature Publishing Group, tillgänglig här.
2. Carr, Steven M. Fluorescerande sekvensering, Tillgänglig här.
3. "Sequencing DNA - Automatiserad sekvensering med fluorescerande färgämnen." JRank artiklar, tillgängliga här.

Image Courtesy:

1. "Alineando secuencias (2)" av Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) via Flickr
2. "Radioactive Fluorescent Seq" Av Abizar på engelska Wikipedia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia