Hur används restriktionsenzymer för att göra rekombinant DNA

Rekombinant DNA är en artificiell typ av DNA som produceras genom att kombinera DNA av två eller flera arter. Processen att framställa rekombinant DNA är känt som molekylär kloning. Det grundläggande förfarandet för molekylär kloning innefattar isolering av DNA, skärning av DNA, anslutning av DNA och amplifiering av det rekombinanta DNA. Genen av intresse införs i vektorn, vilken tjänar som bärarmolekylen för genen av intresse. Vektorn, tillsammans med genen av intresse, hänvisas till det rekombinanta DNA. Huvudrollen hos restriktionsenzymer vid genkloning är att skära DNA. Nyckelfunktionen hos restriktionsenzymer som gör dem lämpliga för DNA-manipulation är att de skär DNA vid specifika mål. Detta möjliggör framställning av önskade DNA-fragment för sammanbindningsändamålet.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är restriktionsenzymer
     - Definition, Egenskaper, Roll
2. Hur används restriktionsenzymer för att göra rekombinant DNA
     - Genkloning, användning av restriktionsenzymer i genkloning

Nyckelvillkor: Skärning av DNA, genkloning, gen av intresse, molekylär kloning, rekombinant DNA-teknik, restriktionsenzymer, vektor

Vad är restriktionsenzymer

Ett restriktionsenzym är ett endonukleas som känner igen korta specifika DNA-sekvenser som är kända som restriktionsställen och klyver DNA-en vid den platsen. De är en typ av biokemiska saxar som produceras av bakterier. Restriktionsenzymer försvarar bakterier från bakteriofager. Dessa enzymer isoleras från bakterier och används för att skära DNA i laboratoriet. Verkan av ett restriktionsenzym visas i Figur 1.

Figur 1: Hindlll-verkan

Förmågan hos restriktionsenzymer att skära DNA på exakta platser tillåter forskare att isolera geninnehållande fragment från genomiskt DNA. Dessa fragment kan sättas in i vektorer för att producera rekombinanta DNA-molekyler.  

Hur används restriktionsenzymer för att göra rekombinant DNA

Rekombinant DNA är en DNA-molekyl som består av DNA av två eller flera arter. Det innehåller främst en gen av intresse från en givarart och en vektor som bär genen av intresse för värdcellen. Huvudstegen för framställning av rekombinanta DNA-molekyler är DNA-isolering, digestion med restriktionsenzymer, ligering av genen av intresse för vektorn och amplifiering av rekombinant DNA-molekyl inuti en värdcell. Hela processen är känd som molekylär kloning. Molekylär kloning visas i figur 2.

Figur 2: Molekylär kloning

Genen av intresse isoleras först från biologiska prover i form av genomiskt DNA, eller det kan amplifieras med PCR. Ibland kan genen av intresse vara närvarande i en vektor. För att införas i vektorn som är lämplig att bära genen av intresse i värdcellen, bör den avskuras från modermolekylen. När restriktionsenzymer skar precis DNA genom att identifiera restriktionsställen kan de användas för detta ändamål. Genen av intresse och vektorn kan digereras med samma restriktionsenzym, eller varje ände av genen av intresse kan digereras av två restriktionsenzymer. Denna digestion producerar kompatibla ändar för ligering av genen av intresse för vektorn. Digestionen med två restriktionsenzymer möjliggör ligering av fragment i den önskade orienteringen. Efter ligering transformeras de resulterande rekombinanta DNA-molekylerna till bakterier för att producera ett stort antal kopior.

Slutsats

Restriktionsenzymer är endonukleaser som skär DNA på specifika platser som kallas restriktionsställen. Egenskaperna hos restriktionsenzymer kan användas för att producera rekombinanta DNA-molekyler genom att skära DNA på exakta platser. Rekombinant DNA innehåller i allmänhet en gen av intresse införd i en vektor.

Referens:

1. "Definition of Restriction enzyme." MedicineNet, tillgängligt här.
2. Griffiths, Anthony JF. "Göra rekombinant DNA." En introduktion till genetisk analys. 7: e upplagan., U.S. National Library of Medicine, 1 Jan. 1970, Tillgänglig här.

Image Courtesy:

1. "HindIII Restriktionsplats och klibbiga ändarvektor" Av Helixitta - Egent arbete (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Konstruera" Av Joyxi - Egent arbete (Public Domain) via Commons Wikimedia