Hur används plasmider i genetisk teknik

Plasmider är en typ av extrakromosomala, cirkulära DNA-molekyler som finns i bakterier och flera typer av eukaryoter. De är en typ av självreplikativa molekyler inuti en cell och är oberoende av det genomiska DNA. Därför kan de användas som bärare av främmande DNA-fragment i olika typer av celler inom genteknik. Den molekylärbiologiska tekniken som är inblandad här är kloning. Geneteknik skapar organismer med nya egenskaper. Dessa nya organismer är kända som genetiskt modifierade organismer (GMO). Denna artikel fokuserar på processen för genteknik, som beskriver användningen av plasmider vid skapandet av nya organismer genom att förändra genomerna.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är plasmider
      - Definition, funktioner
2. Hur används plasmider i genetisk teknik
     - Process av molekylär kloning

Nyckelord: Kloning, DNA, genetisk teknik, genetiskt modifierade organismer (GMO), plasmider

Vad är plasmider

Plasmider är små cirkulära DNA-molekyler som huvudsakligen finns i bakterier. De är extrakromosomala DNA-element, som kan replikera oberoende av bakteriegenomet. Generna som kodas i plasmider hjälper bakterier att överleva under stressförhållanden. Flera till många kopior av plasmider kan naturligt förekomma inuti en bakteriecell. Plasmider kan användas som vektorer som bär utländska DNA-molekyler i både eukaryotiska och prokaryota celler. Funktionerna som hjälper plasmider för att användas som vektorer beskrivs nedan.

Funktioner av plasmider

1. Plasmider kan enkelt isoleras från bakterieceller.
2. De är självreplikativa inuti celler.
3. De är sammansatta av unika restriktionsställen för en eller flera restriktionsenzymer.
4. Införandet av ett främmande DNA-fragment kan inte förändra plasmidernas replikationsegenskaper.
5. Plasmider kan sekventiellt transformeras till olika typer av celler och transformanterna kan väljas baserat på antibiotikaresistensegenskaperna hos de transformerade plasmiderna.

Figur 1: Plasmider

Hur används plasmider i genetisk teknik

Geneteknik är modifieringen av DNA för att producera nya typer av organismer genom att infoga eller radera gener. Införandet av gener kan ske med hjälp av vektorer som plasmider. De viktigaste stegen i genteknik ges nedan.

1. PCR-amplifiering av mål-DNA-sekvensen
2. Digestion av DNA-fragment och plasmider med samma restriktionsenzym
3. Ligering av plasmider och de främmande DNA-fragmenten, som producerar rekombinanta DNA-molekyler.
4. Transformation av de rekombinanta DNA-molekylerna till en önskad typ av celler.
5. Urval av transformerade celler.

De vanligaste vektorerna som används vid kloning isoleras från E coli. Varje plasmid innehåller tre funktionella regioner: replikationsställe, en gen som är ansvarig för antibiotikaresistensen och restriktionsigenkänningssätet för införandet av en främmande gen. Ett särskilt restriktionsenzym används för att skära både plasmid och det främmande DNA-fragmentet. Under restriktionsmältningen blir den cirkulära plasmiden linjär och under ligering kan det främmande DNA-fragmentet införas i de två ändarna, vilket gör plasmiden igen cirkulär. Den rekombinanta plasmiden transformeras till en mottaglig cell som kan vara bakterier, jäst, växt eller djurcell. Produktionen av ett stort antal rekombinanta DNA-molekyler inuti den mottagliga cellen är känd som kloning. De transformerade cellerna kan identifieras genom plasmidets antibiotikaresistens. Transformanten kan emellertid innehålla den ömsesidiga plasmiden eller den rekombinanta plasmiden. Båda typerna av plasmider visar resistens mot antibiotika. Således är en annan gen som LacZ krävs för att identifiera transformanterna med rekombinanta plasmider. Transformanterna med de rekombinanta plasmiderna kallas GMO.

Den detaljerade processen med molekylär kloning visas i figur 2.

Figur 2: Molekylär kloning

Slutsats

Plasmider är cirkulära DNA-molekyler som naturligt förekommer i bakterier. De innehåller gener huvudsakligen för antibiotikaresistens. Plasmider används i genteknik för att överföra främmande genetiskt material till olika typer av celler. Det främmande DNA-fragmentet införs i plasmiden och den rekombinanta DNA-molekylen transformeras till mottagarcellen. De transformerade cellerna väljs av den använda plasmidens antibiotikaresistens.  

Referens:

1. Lodish, Harvey. "DNA-kloning med plasmidvektorer". Molecular Cell Biology. 4: e upplagan., U.S. National Library of Medicine, 1 jan 1970, www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21498/.

Image Courtesy:

1. "Plasmid (engelska)" Av användare: Spaully på engelska wikipedia - Egent arbete (CC BY-SA 2.5) via Wikimedia Commons
2. "Figur 17 01 06" Genom CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia