Skillnad mellan omvänd fas och hydrofob interaktionskromatografi

De huvudskillnad mellan omvänd fas och hydrofob interaktionskromatografi är att omvänd faskromatografi (RPC) använder ett mer hydrofobt medium, vilket leder till mer starkare interaktioner medan den hydrofoba interaktionskromatografi (HIC) använder ett mindre hydrofobt medium när det jämförs med mediet i omvändfas-kromatografi.  

Omvänd faskromatografi och hydrofob interaktionskromatografi är två kromatografiska tekniker som beror på interaktionerna mellan hydrofoba ytor av ett kromatografimedium och de hydrofoba fläckarna på ytan av biomolekyler.

Viktiga områden som omfattas

1. Vad är omvänd faskromatografi
     - Definition, steg, applikationer
2. Vad är hydrofobisk interaktionskromatografi
     - Definition, steg, applikationer
3. Vad är likheterna mellan omvänd faskromatografi och hydrofobisk interaktionskromatografi
     - Översikt över gemensamma funktioner
4. Vad är skillnaden mellan omvänd faskromatografi och hydrofobisk interaktionskromatografi
     - Jämförelse av viktiga skillnader

Nyckelbegrepp

Hydrofobisk interaktionskromatografi, HIC, Media, Reverse Phase Chromatography, RPC

Vad är omvänd faskromatografi

Omvänd faskromatografi (RPC) är en kromatografisk teknik som användes vid rening och analys av biomolekyler, såsom proteiner, peptider och oligonukleotider. Det ger en separation med hög upplösning och är idealisk för peptidmappning och renhetskontroll. RPC används oftare vid slutlig polering av peptider och oligonukleotider.

Två huvudtyper av hydrofoba media kan användas som den stationära fasen: kiseldioxidpärlor täckta med kolkedjor eller nakna hydrofoba polymerer. En kolonn är packad med det hydrofoba mediet i en form av packad bädd på vilken provet appliceras. Ett jonparningsmedel såsom trifluorättiksyra (TFA) kan sättas till mobilfasen för att förbättra bildandet av hydrofoba interaktioner. En organisk modifierare, såsom 5% acetonitril, användes i början och eluering kan initieras med ökningen av% acetonitril.

Figur 1: Omvänd faskromatografisteori

Biomolekyler som är mindre hydrofoba / mer polära kommer att eluera först medan de mer hydrofoba molekylerna kommer att eluera senare. RPC är den kromatografiska tekniken med högsta upplösning.

Vad är hydrofobisk interaktionskromatografi

Hydrofob interaktionskromatografi (HIC) är den andra tekniken som används vid separation av biomolekyler baserat på hydrofobiciteten under måttliga betingelser. Det är en idealisk metod för rening av proteiner när proverna måste utsättas för ammoniumsulfatutfällning i den ursprungliga provkoncentrationen och upprensningen. Den förhöjda saltnivån under ammoniumsulfatutfällningen ökar interaktionen mellan hydrofoba komponenter.

Figur 2: Effekt av hög saltkoncentration på hydrofoba interaktioner

Det hydrofoba mediet av HIC består av en inert matris av sfäriska partiklar belagda med ligander innehållande alkyl- eller arylgrupper. De hydrofoba interaktionerna uppträder under måttligt höga saltkoncentrationer (vanligen 1-2 M ammoniumsulfat eller 3 M NaCl). Startbufferten säkerställer bindning av proteiner av intresse för mediet medan tvättade föroreningar bort. Elueringsbufferten innehåller låg saltkoncentration, vilket försvagar interaktionen mellan proteiner och den stationära fasen.

Likheter mellan omvänd faskromatografi och hydrofobisk interaktionskromatografi

• Omvänd fas och hydrofob interaktionskromatografi är två tekniker som används vid separation av biomolekyler baserat på deras hydrofobicitet.
• Den mobila fasen av båda teknikerna är antingen vatten eller ett organiskt lösningsmedel.
• De använder packade sängkolumner.
• Startbuffert säkerställer bindning av önskade molekyler till kolonnen.
• Molekyler med den lägsta hydrofobiciteten kan eluera först medan mer hydrofoba molekyler kan eluera senare.
• Det slutliga tvättsteget eluerar de tätt bundna molekylerna.
• Upplösningen av båda teknikerna är en kombination av selektiviteten (graden av separation mellan topparna), effektivitet (förmågan att producera smala symmetriska toppar) av tekniken, provets massa och retentionstiden.

Skillnad mellan omvänd faskromatografi och hydrofobisk interaktionskromatografi

Definition

Omvändfas-kromatografi (RPC) hänför sig till separation med högsta upplösningsteknik baserad på molekylernas hydrofobicitet i en blandning, medan hydrofob interaktionskromatografi (HIC) avser en typ av separationsteknik baserad på hydrofobiciteten men verkar under relativt milda betingelser.

hydrofobicitet

RPC opererar under mer hydrofoba betingelser medan HIC verkar under relativt milda hydrofoba betingelser.

interaktioner

Omvänd faskromatografi leder till starkare interaktioner mellan molekyler och den stationära fasen som måste reverseras under eluering med en organisk modifierare medan HIC leder till måttligt höga interaktioner mellan den stationära fasen och molekylerna.

Hydrofob media

RPC använder antingen silikakulor täckta med kolkedjor eller nakna hydrofoba polymerer medan HIC använder en inert matris av sfäriska partiklar belagda med ligander innehållande alkyl- eller arylgrupper.

Startbuffert

Startbufferten i RPC använder trifluorättiksyra (TFA) medan startbufferten av HIC använder måttligt höga saltkoncentrationer.

eluering

Den ökade andelen acetonitril börjar elueringen i RPC medan den minskande saltkoncentrationen börjar elueringen i HIC.  

Upplösning

Omvänd faskromatografi är kromatografisk teknik med högsta upplösning medan upplösningen av HIC är låg jämfört med RPC.

tillämpningar

RPC används vid separation av proteiner, peptider och oligonukleotider medan HIC huvudsakligen används vid rening av proteiner.

Slutsats

Omvändfaskromatografi är den kromatografiska tekniken med den högsta upplösningen, vilken arbetar under mycket hydrofoba förhållanden. Men HIC arbetar under moderata hydrofoba förhållanden. RPC och HIC är de två typerna av separationstekniker baserade på hydrofobiciteten. Huvudskillnaden mellan RPC och HIC är graden av hydrofobicitet som används i varje teknik.

Referens:

1. Hydrofobisk interaktion och omvänt faskromatografi: Principer och metoder. GE Healthcare, 2006. Tillgänglig här

Image Courtesy:

1. "Reverse Phase Gradient Elution Schematic" Genom Nategm - Egent arbete (CC BY-SA 4.0) via Wikimedia Commons   
2. "Hicsalt" Av Daliak på engelska Wikibooks - Överförd från en.wikibooks till Commons. (Public Domain) via Commons Wikimedia