Skillnad mellan DNA och RNA-extraktion

De huvudskillnad mellan DNA och RNA-extraktion är att pH-nivån på DNA-extraktion är pH 8 medan pH-nivån för RNA-extraktion är pH 4,7. DNA tenderar att denaturera och flytta till den organiska fasen vid surt pH. Vid alkaliskt pH genomgår RNA alkalisk hydrolys på grund av närvaron av 2'OH i ribosockret.  

DNA- och RNA-extraktion är de två förfarandena som är involverade i isolering och rening av nukleinsyror från cellerna i vävnader. Båda förfarandena består av tre steg. God kvalitet DNA och RNA spelar en viktig roll i molekylärbiologi, bioteknik, genomik och epidemiologiska experiment. 

Viktiga områden som omfattas 

1. Vad är DNA-extraktion
     - Definition, Förfarande
2. Vad är RNA-extraktion
     - Definition, Förfarande
3. Vad är likheterna mellan DNA och RNA-extraktion
     - Översikt över gemensamma funktioner
4. Vad är skillnaden mellan DNA och RNA-extraktion
     - Jämförelse av viktiga skillnader

Nyckelvillkor: Cellljus, Denaturering av Proteiner, DNA-extraktion, pH, Precipitation, RNA-extraktion

Vad är DNA-extraktion

DNA-extraktion är isolerings- och reningsproceduren för DNA. DNA kan isoleras från blod, frysta vävnadsprover eller paraffinvävnadsblock. De tre stegen av DNA-extraktion är cellljus, isolering av DNA och utfällning. Under cellljus bryts cellmembranbarriärer, såsom cellmembran och membran av kärnan, för att exponera DNA. Nästa steg är avlägsnandet av membranlipider från provet. Slutligen innebär utfällningen av DNA borttagandet av DNA-associerade proteiner genom proteas och avlägsnandet av RNA med RNas.

Figur 1: DNA-extraktionsprocedur

Grundläggande protokoll för DNA-extraktion

Nedan visas de grundläggande protokollen för DNA-extraktion. 

1. Celllys med celllysbufferten till lyscellmembran

2. Lipider bryts ner med tvättmedel och ytaktiva ämnen

3. Digestion av proteiner genom tillsats av proteas

4. Digestion av RNA genom tillsats av RNas

5. Separering av cellrester, digererade proteiner, lipider och RNA genom tillsats av koncentrerat salt följt av centrifugering

6. Etanolutfällning av DNA med iskall etanol eller isopropanol. Jonstyrkan hos natriumacetat kan användas för att förbättra utfällningen. Det utfällda DNA framträder som trådar i den slutliga lösningen.

Figur 2: Extraktad DNA

Fenolkloroformutvinning kan också användas för att separera DNA från proteiner. Här denaturerar fenol proteinerna i provet och DNA kvarstår i vattenfasen i slutet av extraktionen. Och i den organiska fasen kan du hitta de denaturerade proteinerna. En annan metod för att extrahera DNA är minikolonnreningen. Här beror bindning av DNA i kolonnen på buffertens pH och saltkoncentration. 

Vad är RNA-extraktion 

RNA-extraktion hänför sig till processen att rena RNA från prover. Den konventionella metoden för RNA-extraktion kallas guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform extraktion. Guanidiniumtiocyanat denaturerar proteiner. Dessutom stör det vätebindning av vattenmolekyler och tjänar som det kaotropa medlet. Ett speciellt reagens används i RNA-extraktionen kallad Tri-reagens. Den innehåller guanidiniumtiocyanat, fenol och natriumacetat. Syftet med de grundläggande stegen i RNA-extraktion är liknande det för DNA-extraktion. Protokollet för RNA-extraktion beskrivs nedan. 

1. Celler tvättas med iskall PBS för att upprätthålla cellens osmolaritet. 

2. Aspirera cellerna och homogenisera provet med Tri-reagens.  

3. Tillsätt kloroform och skaka. 

4. Centrifugering kan resultera i tre lager. Det övre skiktet är det vattenhaltiga skiktet, vilket är klart. Mellanlaget eller interfasen innehåller det utfällda DNA: et. Bottenskiktet är det organiska skiktet, vilket är rosa. 

5. Ta bort vattenskiktet och sätt isopropanol. Centrifugering kan resultera i en pellets.  

6. Tvätta pelleten med 75% etanol. Lufttorka pelleten. 

7. Lös upp pelleten med TE-buffert eller vatten.

Figur 3: Fenol-kloroform extraktion av RNA

RNA-extraktion utförs vanligen vid pH under 7. Vid alkaliskt pH är RNA mer benägna att nedbrytas genom alkalisk hydrolys på grund av närvaron av en OH-grupp vid 2'-positionen av ribosockret. Dessutom tenderar RNA att förbli i vattenfasen vid surt pH. Däremot tenderar DNA att denaturera och flytta in i den organiska fasen vid surt pH. Därför kan DNA-extraktion utföras vid ca pH 8. DNA består av deoxiribosocker och genomgår inte alkalisk hydrolys.  

Likheter mellan DNA och RNA-extraktion 

• DNA- och RNA-extraktion är förfarandena involverade i isolering och rening av nukleinsyror från biologiska prover. 
• Båda förfarandena innefattar celllys, rening av nukleinsyror från skräp och associerade proteiner och framställning av extrakten. 
• För båda procedurerna måste bibehålla kalla förhållanden hela tiden. 
• Involverar centrifugering vid separation av komponenter i blandningen. 
• Behöver inaktivera nukleasenzymernas aktivitet under båda förfarandena. 
• Fenol-kloroformutvinning är ett av de kritiska stegen i båda typerna av extraktioner. 
• Guanidiniumtiocyanat kan användas för att skydda nukleinsyror.  
• Utfällning av RNA kan göras med isopropanol. 
• Jonstyrkan hos natriumacetat används för att förbättra utfällningen av nukleinsyror.  
• Proven kan kvantifieras genom mätning av OD vid 260 nm. 

Skillnad mellan DNA och RNA-extraktion 

Definition 

DNA-extraktion: Isolering och rening av DNA

RNA-extraktion: Process för rening av RNA från prover

Typ av nukleinsyra extraherad 

DNA-extraktion: DNA 

RNA-extraktion: RNA 

pH 

DNA-extraktion: Utfärdad i 8 

RNA-extraktion: Utfärdad i 4.7 

Steg 

DNA-extraktion: Bryt cellmembranen eller celllysen, avlägsna membranlipiderna och fälla ut DNA: n 

RNA-extraktion: Celllys, guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformutvinning, beredning med isopropanol 

Användning av DEPC-behandlat vatten 

DNA-extraktion: Ingen 

RNA-extraktion: Alla reagens framställs med DEPC-behandlat vatten

Lagring 

DNA-extraktion: DNA kan extraheras tidigare och lagras i satser

RNA-extraktion: RNA-extraktion görs strax före nedströms procedurer

Långvarig lagring 

DNA-extraktion: Vid -20 ° C

RNA-extraktion: Vid -80 ° C 

Slutsats 

DNA-extraktion utförs vid pH 8. DNA tenderar att flytta till den organiska fasen, eftersom denaturerar vid surt pH. Men RNA-extraktion utförs vid lågt pH för att förhindra nedbrytning genom alkalisk hydrolys. Det grundläggande syftet med stegen i både DNA- och RNA-extraktion är liknande. Huvudskillnaden mellan DNA och RNA-extraktion är de pH-betingelser som används vid varje typ av extraktion. 

Referens:

1. "Grunden för DNA-extraktion". Alaska BioPREP Virtual Textbook, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, tillgänglig här
2. "RNA-isolering och omvänd transkriptionsprotokoll: celler i kultur". Abcam, tillgängligt här

Image Courtesy:

1. "Figur 17 01 02" Genom CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia  
2. "DNA-extraktion" av Joo Nath - eget arbete (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia  
3. "PhOH-CHCl3 extraktion" Av Squidonius (talk) - Egent arbete (Originaltext: Självgjorda) (Public Domain) via Commons Wikimedia