Skillnad mellan RT PCR och QPCR

Huvudskillnad - RT PCR vs QPCR
 

Polymeraskedjereaktion är en teknik som används för att amplifiera en specifik DNA-region in vitro. På grund av uppfinningen av denna teknik av Kary Mullis 1983 kan forskare göra tusen till miljoner kopior av specifika DNA-fragment för forskningsändamål. För närvarande har det blivit en vanlig och rutinmässigt utförd teknik i kliniska och forskningslaboratorier för en mängd olika tillämpningar. Det finns variationer av traditionell PCR-teknik, såsom RT PCR, kapslad PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT-QPCR etc. RT PCR och Q PCR är två viktiga variationer av PCR. Den viktigaste skillnaden mellan RT PCR och Q PCR är det RT PCR används för att detektera genuttryck genom att skapakomplementärt DNA (cDNA) transkript från RNA medan Q PCR används för att kvantitativt mäta PCR-produkterna i realtid med hjälp av fluorescerande färgämnen.

INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är RT PCR
3. Vad är QPCR
4. Jämförelse vid sida vid sida - RT PCR vs QPCR
5. Sammanfattning

Vad är RT PCR?

Omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (RT PCR) är en variant av PCR som används för att detektera RNA-uttryck. Det är en mycket viktig metod för att detektera mRNA-uttryck i vävnader. RT PCR används när utgångsmaterialet i provet är RNA. I RT-PCR omvandlas mall-mRNA först till komplementärt DNA. Detta steg katalyseras av enzymet omvänd transkriptas och förfarandet är känt som omvänd transkription. För det andra används traditionell PCR för det nyligen syntetiserade cDNA för amplifieringen.

RT PCR är en mycket känslig teknik som kräver en relativt liten mängd RNA-prov. RT PCR används vanligen vid diagnos och kvantifiering av RNA-arter, speciellt RNA-virus, såsom humant immunbristvirus och hepatit C-virus.

Figur 01: RT-PCR-teknik

Vad är QPCR?

Kvantitativ PCR (QPCR) är en variant av PCR som används för att kvantitativt mäta PCR-produkterna. Det kallas även som realtids polymeras kedjereaktion eftersom det mäter förstärkningen av realtid med realtid PCR-maskin. Det är en lämplig metod för bestämning av mängden av en målsekvens eller gen närvarande i ett prov. Den intressanta egenskapen hos QPCR är att den kombinerar både förstärkning och sann kvantifiering i ett enda steg. Därför kan behovet av gelelektrofores vid detektion elimineras med QPCR-teknik. QPCR använder fluorescerande färgämnen för att märka PCR-produkter under PCR-reaktionerna som så småningom leder till direkt kvantifiering. När PCR-produkterna ackumuleras ackumuleras de fluorescerande signalerna och det kommer att mätas av realtidsmaskinen. QPCR kan kombineras med RT PCR. Det är känt som RT-QPCR eller QRT-PCR och anses vara en kraftfull, känslig och kvantitativ metod för detektering av RNA-nivåer i cellerna eller vävnaderna.

SYBR Green och Taqman är två metoder som används för att upptäcka eller titta på förstärkningsprocessen för realtids-PCR. SYBR Green-metoden utförs med användning av ett fluorescerande färgämne som kallas SYBR-grönt och detekterar amplifieringen genom att binda färgämnet för att producera dubbelsträngat DNA. Taqman utförs med användning av dubbelmärkta prober och detekterar amplifieringen genom nedbrytning av proben genom Taq-polymeras och frisättningar av fluoroforen såsom visas i figur 02. Båda metoderna övervakar framstegen i amplifieringsprocessen och rapporterar kvantiteten av produktens realtid.

Realtids-PCR har ett brett utbud av applikationer såsom genuttryckskvantifiering, mikroRNA och icke-kodande RNA-analys, SNP-genotypning, detektering av kopiantalvarianter, detektering av sällsynta mutationer, detektering av genetiskt modifierade organismer, upptäckt av smittsamma medel etc..

Figur 02: Kvantitativ PCR-teknik

Vad är skillnaden mellan RT PCR och QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR är en teknik som används för att detektera genuttryck genom amplifiering.	QPCR är en teknik som förstärker DNA och kvantifierar PCR-produkterna i realtid.
Inblandning av Reverse Transcriptase Enzyme
Enzym revers transkriptas används för RT PCR.	Enzym revers transkriptas används inte för QPCR.
Användning av fluorescensmärkta molekyler
Fluorescensmärkta färgämnen eller prober används inte för RT PCR.	Fluorescensmärkta färgämnen eller prober används för QPCR.
Kvantificering av PCR-produkt
Om inte kombinerat med QPCR kvantifierar RT PCR inte PCR-produkten.	QPCR mäter kvantitativt PCR-produkten.
Startmaterial
Utgångsmaterial är mRNA.	Utgångsmaterial är DNA.
Syntes av cDNA
Komplementärt DNA produceras under RT PCR.	Komplementärt DNA produceras inte under QPCR.

Sammanfattning - RT PCR vs QPCR

RT PCR och QPCR är två versioner av traditionell PCR. RT PCR-teknik utförs för mRNA-prover och den drivs av omvänt transkription och produktion av cDNA. QPCR används för att kvantifiera PCR-produkter under realtids PCR-termiska cykler med användning av fluorescerande färgämnen eller märkta prober. I QPCR representeras mängden PCR-produkt av de utsända fluorescerande signalerna av provet. RT PCR används i allmänhet som en amplifieringsprocess, medan QPCR vanligen används som en kvantifieringsprocess. Detta är skillnaden mellan RT PCR och QPCR.

referenser:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo och GK Agrawal. "Realtids-PCR: Revolutioniserande detektion och expressionanalys av gener." Nuvarande genomik. Bentham Science Publishers Ltd., juni 2007. Web. 03 april 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh och Jo Vandesompele. "Lättgående och känslig RT-qPCR-baserad genuttrycksanalys av FFPE-prover." Nature News. Nature Publishing Group, 22 februari 2016. Web. 03 april 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon, och C. Mathieu. "Användningen av realtids-omvänd transkriptas-PCR för kvantifiering av cytokingenuttryck". Journal of Biomolecular Techniques: JBT. Sammanslutningen av biomolekylära resurser, mars 2003. Web. 03 april 2017

Image Courtesy:
1. "Taqman" Av användare: Braindamaged - eget arbete av den ursprungliga uppladdaren (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Omvänd transkriptionspolymeras kedjereaktion" Av Jpark623 - Egent arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia