Skillnad mellan Northern Southern och Western Blotting

Huvudskillnad - Northern vs Southern vs Western Blotting
 

Detektion av specifika sekvenser av DNA, RNA och proteiner är avgörande för olika typer av studier inom molekylärbiologi. Gelelektrofores är en teknik som separerar DNA, RNA och proteiner i enlighet med deras storlekar. Från gelprofilerna identifieras speciell DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein med de speciella teknikerna som kallas blotting och hybridisering med märkta prober. Det finns tre olika typer av blotting metoder, nämligen södra, norra och västra. Nyckelfaktorn mellan nordlig sydlig och västlig blotting ligger med typen av molekylen det detekterar från ett prov. Southern blotting är en metod som detekterar en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov. Northern blotting är en teknik som detekterar en specifik RNA-sekvens från ett RNA-prov. Western blotting är en metod som detekterar ett specifikt protein från ett proteinprov.

INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är Southern Blotting
3. Vad är Northern Blotting
4. Vad är Western Blotting
5. Jämförelse vid sida vid sida - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Sammanfattning

Vad är Southern Blotting?

Southern blotting teknik utvecklades av E. M. Southern 1975 för identifiering av en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov. Detta är den första blottingstekniken som introduceras i molekylärbiologi. Det möjliggjorde detektering av specifika gener från DNA, specifika fragment från DNA, etc. Det finns flera steg involverade i södra blottingsteknik. De är som följer.

1. DNA isoleras från provet och digereras med restriktionsendonukleaser.
2. Digererat prov separeras genom agarosgelelektrofores.
3. DNA-fragment i gelén denatureras till enskilda strängar med användning av en alkalisk lösning.
4. Enkangsträngat DNA överförs till ett nitrocellulosafiltermembran genom kapilläröverföring.
5. Överfört DNA fixeras permanent på membranet.
6. Fast DNA på membranet hybridiseras med märkta prober.
7. Obundet DNA tvättas av från membranet genom tvättning.
8. Röntgenfilm exponeras för membranet och en autoradiograf framställs.

Southern blotting appliceras för olika aspekter av molekylärbiologi. Det är användbart vid RFLP-kartläggning, rättsmedicinska studier, DNA-metylering vid genuttryck, detektion av muterade gener i genetiska störningar, DNA-fingeravtryck, etc.

Figur 01: Southern Blotting Technique

Vad är Northern Blotting?

Northern blotting är en metod avsedd att detektera en specifik RNA-sekvens eller mRNA-sekvens från ett prov för att studera genuttryck. Denna teknik utvecklades av Alwine, Kemp och Stark 1979. Det skiljer sig från de sura och västra blottingsteknikerna på grund av flera steg. Denna teknik utförs emellertid också via gelelektrofores, blottning och hybridisering med specifika märkta prober och detektion. Northern blotting teknik utförs enligt följande.

1. RNA extraheras från provet och separeras genom gelelektrofores.
2. RNA överförs från gelén till ett blottningsmembran och fixeras.
3. Membranet behandlas med en märkt prob framställd från cDNA eller RNA (proben är komplementär till en specifik sekvens i provet).
4. Sonden inkuberas med membranet för att binda med en specifik sekvens.
5. Obundna prober tvättas bort.
6. Hybridiserade fragment detekteras av en autoradiograf.

Northern blotting är ett viktigt verktyg för detektion och kvantifiering av hybridiserat mRNA, studerande av RNA-nedbrytning, utvärdering av RNA-halveringstid, detektering av RNA-splitsning, studie av genuttryck, etc.

Figur 02: Northern Blotting

Vad är Western Blotting?

Western blotting är ett sätt att detektera ett specifikt protein från en proteinblandning med användning av märkt antikropp. Därför är western blot också känd som en immunoblot. Denna teknik introducerades av Towbin et al 1979, och det utförs nu rutinmässigt i laboratorierna för proteinanalys. Steg är som följer.

1. Proteiner extraheras från provet
2. Proteiner separeras av deras storlekar med användning av polyakrylamidgelelektrofores
3. Separerade molekyler överförs till ett PVDF-membran eller nitrocellulosamembran genom elektroporation
4. Membranet är blockerat för ospecifik bindning med antikropparna
5. Överförda proteiner är bundna med primär antikropp (enzymmärkta antikroppar).
6. Membranet tvättas för att avlägsna icke-specifikt bundna primära antikroppar
7. Bundet antikroppar detekteras genom att tillsätta ett substrat och detektera den bildade färgade fällningen

Western blotting är användbar vid detektion av anti-HIV-antikroppar i ett humant serumprov. Western blot kan också användas som bekräftande test för infektion med hepatit B och slutgiltigt test för galna ko sjukdomar.

Figur 03: Western Blotting

Vad är skillnaden mellan Northern Southern och Western Blotting?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Typ av molekyl som detekterats
Northern Blotting	Northern blotting detekterar en specifik RNA-sekvens från ett RNA-prov.
Southern Blotting	Southern blotting detekterar en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov.
Western Blotting	Western blotting detekterar ett specifikt protein från ett proteinprov.
Typ av gel
Northern Blotting	Detta använder agaros / formaldehydgel.
Southern Blotting	Detta använder en agarosgel.
Western Blotting	Detta använder polyakrylamidgel.
Blotting Method
Northern Blotting	Detta är en kapillär överföring.
Southern Blotting	Detta är en kapillär överföring.
Western Blotting	Detta är en elektrisk överföring.
Prober används
Northern Blotting	cDNA eller RNA-prober märkta radioaktivt eller icke-radioaktivt.
Southern Blotting	DNA-prober märks radioaktivt eller icke-radioaktivt.
Western Blotting	Primär antikroppar används som prober.
Detektionssystem
Northern Blotting	Detta görs med hjälp av en autoradiograf eller detektering av ljus eller färgförändring.
Southern Blotting	Detta görs med hjälp av en autoradiograf, detektering av ljus eller färgförändring.
Western Blotting	Detta görs genom att detektera ljus eller färgförändring.

Sammanfattning - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting är en speciell teknik som utvecklats för identifiering av specifikt DNA, RNA eller protein från proverna. Det finns tre separata blottingprocedurer, nämligen norra, södra och västra, för att detektera en specifik typ av molekyl. Northern Blotting Technique är konstruerad för att detektera en specifik RNA-sekvens från en blandning av RNA. Southern blotting teknik möjliggör detektion av en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov och western blotting teknik utvecklas för att identifiera ett specifikt protein från en proteinblandning.

referenser
1. Gibbons, Janay. "Western Blot: Protein Transfer Överblick." Nordamerikanska Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, mar. 2014. Web. 27 mars 2017
2. Brown, T. "Southern blotting." Nuvarande protokoll i immunologi. U.S. National Library of Medicine, maj 2001. Web. 27 mars 2017
3. Han, Shan L. "Northern blot". Metoder i enzymologi. U.S. National Library of Medicine, 2013. Web. 27 mars 2017

Image Courtesy:
1. "Northern Blot Scheme" av RNA405 - eget arbete (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Western blot 114A" Av Amanthabagdon - Egent arbete (Public Domain) via Commons Wikimedia