Skillnad mellan Nick Translation och Primer Extension

Huvudskillnad - Nick Translation vs Primer Extension
 

Nick-översättning och primerförlängning är två viktiga tekniker som utförs i molekylärbiologi. Den viktigaste skillnaden mellan nick översättning och primer förlängning är det nick translationsprocessen producerar märkta prober för andra hybridiseringstekniker medan primerförlängningsmetod identifierar en specifik RNA-sekvens från en blandning och avslöjar information om uttrycket av mRNA. Båda teknikerna har stor betydelse och utförs rutinmässigt i molekylärforskningslaboratorier.

INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är Nick Translation
3. Vad är Primer Extension
4. Sida vid sida Jämförelse - Nick Translation vs Primer Extension
5. Sammanfattning

Vad är Nick Translation?

Nick-översättning är en viktig teknik som används för att framställa märkta prober för olika molekylära biologiska tekniker, såsom blotting, in situ hybridisering, fluorescerande in situ hybridisering etc. Det är en in vitro Metod för DNA-märkning. DNA-prober används för att identifiera specifika DNA- eller RNA-sekvenser. Med hjälp av en märkt sond kan specifika fragment markeras eller visualiseras från en komplex blandning av nukleinsyra. Därför framställs märkta prober med användning av olika tekniker som skall användas för olika tekniker. Nick-översättning är en sådan metod som producerar märkta prober med hjälp av DNase 1 och DNA-polymeras 1-enzymer.

Nick translationsprocessen börjar med enzymaktivitet av DNase 1. DNase 1 introducerar nicks i fosfat-ryggraden i dubbelsträngat DNA genom klyvning av fosfodiesterbindningar mellan nukleotider. När nicket är skapat fria 3'-OH-gruppen av nukleotiden kommer att erhållas och DNA-polymeras 1-enzym kommer att reagera på det. 5 'till 3'-exonukleasaktiviteten av DNA-polymeras 1 avlägsnar nukleotider från nicket mot DNA-strängens 3'-riktning. Samtidigt arbetar polymerasaktivitet av DNA-polymeras 1-enzym och adderar nukleotider för att ersätta de borttagna nukleotiderna. Om nukleotiderna märktes, kommer utbytet att ske med de märkta nukleotiderna och det kommer att markera DNA för identifiering. Detta nyligen syntetiserade märkta DNA kan användas som prober i olika hybridiseringsreaktioner i molekylärbiologi.

Figur 01: Nick översättningsprocess

Vad är Primer Extension?

Primerförlängning är en teknik som används för att hitta specifik RNA-sekvens från en RNA-blandning och lokalisera 5'-änden av mRNA-transkriptet. Det används också för att studera strukturen av RNA och uttryck. Primerförlängningsmetod utförs med märkta primers eller med märkta nukleotider. Om märkta primers används, utesluter det behovet av att märka nukleotiderna som används för syntesen av cDNA. Det finns flera steg i denna teknik. Det börjar med extraktion av RNA från provet. Därefter tillsätts en märkt oligonukleotidprimer till blandningen tillsammans med de nödvändiga ingredienserna för att syntetisera cDNA av en specifik RNA-sekvens. Primer annealerar med den komplementära sekvensen från blandningen. Genom att använda den primerglödgade sekvensen som mallen syntetiserar det omvända transkriptaset enzymet det komplementära DNA (cDNA) av RNA-sekvensen. Primerglödgning och omvänd transkription sker endast när den specifika RNA-sekvensen är närvarande i provet. När slutligen denatureringsgelelektrofores utförs kan storleken på RNA-sekvensen bestämmas. Det är också lätt att hitta +1-basen av mRNA-sekvensen (transkriptionsinitieringssiten) med primerförlängningsmetoden. Mängden mRNA närvarande i provet kan kvantifieras med detta förfarande om överskott av primer används.

Figur 02: Primerförlängning

Vad är skillnaden mellan Nick Translation och Primer Extension?

Nick Translation vs Primer Extension
Nick-översättning är en process som skapar märkta DNA-prober för olika hybridiseringsreaktioner.	Primerförlängning är en teknik som används för att hitta specifikt RNA eller att studera genuttryck.
Enzymer används
DNase 1 och DNA-polymerasenzymer används.	Omvänd transkriptasenzym används.
Betydelse
Nick-översättning underlättar märkningen av specifik DNA-sekvens.	Primerförlängning möjliggör detektering av specifik mRNA-sekvensstorlek och mängden närvarande i provet.

Sammanfattning - Nick Translation vs Primer Extension

Nick-översättning är en metod som används för att syntetisera märkta prober baserat på aktiviteterna i DNase 1 och E coli DNA-polymeras 1-enzymer. Det är en in vitro metod som används i laboratorierna före olika hybridiseringstekniker. Under nick-translationen avlägsnar 5'-3'-exonukleasaktiviteten hos DNA-polymeras 1 nukleotider före nick och polymerasaktiviteten hos DNA-polymeras 1 ersätter de borttagna nukleotiderna med märkta nukleotider bakom nicket. Primerförlängning är en metod som används för att detektera ett specifikt RNA-transkript från en blandning och kvantifiera storleken och mängden av intresse-RNA. Detta är skillnaden mellan nick översättning och primer förlängning.

referenser
1. Reid, Alex. "Nick Translation." Springer. N.p., n.d. Webb. 18 april 2017
2. "Primer Extension." National Diagnostics. N.p., n.d. Webb. 19 april 2017
3. Kuo, M. T. och W. Plunkett. "Nick-translation of metaphase chromosomes: in vitro-märkning av nukleas-överkänsliga regioner i kromosomer." Förlopp från National Academy of Sciences i USA. U.S. National Library of Medicine, Feb. 1985. Web. 19 april 2017
4. Raymond et al. "Enkel, kvantitativ primer-förlängning PCR-analys för direkt övervakning av mikroRNA och kort-interfererande RNA." RNA. Copyright 2005 av RNA Society, Nov. 2005. Web. 19 april 2017

Image Courtesy:
1. "Primer Extension Assay" Av Jjnmmnjj - eget arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia