Skillnad mellan Maxam Gilbert och Sanger Sequencing

Huvudskillnad - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
 

Nukleotider är de grundläggande strukturella enheterna och byggstenarna av DNA. DNA-molekylen är sammansatt av en polynukleotidkedja. Det finns fyra olika nukleotider som finns i DNA. Dessa nukleotider är sammansatta av fyra olika kvävebaser benämnda A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (tymin). Nukleotidernas ordning i DNA-molekylen har stor betydelse eftersom den kodar för en viktig genetisk information för tillväxt och utveckling av organismer. DNA-sekvensering hänför sig till processen som bestämmer DNA: s exakta nukleotidsekvens. Det finns olika DNA-sekvenseringsmetoder. Maxam Gilbert-sekvensering och Sanger DNA-sekvensering är två metoder för DNA-sekvensering som hör till sekvensering av första generationen. Maxam Gilbert-sekvenseringsproceduren bestämmer bassekvensen genom klyvning av de 5'-ändmärkta DNA-fragmenten företrädesvis vid var och en av fyra nukleotider och gelelektrofores. Sanger-sekvenseringsförfarandet bestämmer nukleotidsekvensen genom syntetisering av enkelsträngat DNA med användning av DNA-polymeras och dideoxynukleotider och gelelektrofores. Detta är nyckelfaktorn mellan Maxam Gilbert och Sanger Sequencing.

INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är Maxam Gilbert
3. Vad är Sanger Sequencing
4. Jämförelse vid sida vid sida - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
5. Sammanfattning

Vad är Maxam Gilbert Sequencing?

Maxam Gilbert-sekvensering, även känd som kemisk sekvenseringsmetod, är en teknik som utvecklades för att bestämma nukleotidernas ordning i DNA. Denna metod introducerades av Walter Gilbert och Alan Maxam 1976 och blev populär eftersom den kan utföras direkt med renat DNA. Maxam Gilbert-metoden hör till den första generationen av DNA-sekvensering, och det var den första sekvenseringsmetoden som används i stor utsträckning av forskare.

Grundprincipen för denna metod ligger i begränsningen av de slutmärkta DNA-fragmenten vid specifika baser med basspecifika kemikalier och betingelser och separation av de märkta fragmenten genom elektrofores såsom visas i figur 01. Fragment separeras i enlighet med deras storlekar på gel. Eftersom fragmenten är märkta kan DNA-molekylens sekvens lätt härledas.

Maxam gilbert-metoden använder basspecifika kemikalier för att bryta DNA vid specifika baser. Två vanliga kemikalier som heter dimetylsulfat och hydrazinkemikalier används för att selektivt attackera puriner respektive pyrimidiner.

Maxam Gilbert-sekvenseringsmetoden utförs via flera steg enligt följande.

1. Rening av DNA-sekvensen med användning av restriktionsendonukleaser
2. Märkning av ändarna av DNA-fragmenten genom tillsats av radioaktiva fosfater
3. Rening av de märkta fragmenten från icke-märkta fragment med gelelektrofores
4. Separering av det slutmärkta DNA i fyra rör och behandling med basspecifika kemikalier separat
5. Elektrofores av innehållet i varje rör på separata linjer på en gel och fragment separation enligt deras längd.
6. Detektion av fragmenten med autoradiograf.

Figur 01: Maxam Gilbert-sekvensering

Vad är Sanger Sequencing?

Sanger Sequencing är en sekvenseringsmetod som utvecklats av Frederick Sanger och hans kollegor 1977 för att bestämma bassekvensen för ett givet DNA-fragment. Det är också känt som kedjestoppsekvensering eller Dideoxy-sekvenseringsmetod. Denna metod arbetar med principen om selektiv inkorporering av kedjestoppande dideoxynukleotider (ddNTPs) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP och ddTTP med DNA-polymeras under syntesen av enkelsträngad DNA för att avsluta strängbildningen. Dideoxynukleotider saknar 3'-OH-grupper för bildning av fosfodiesterbindningar med intilliggande nukleotid. Följaktligen stoppar strängbildningen när en ddNTP införlivas i nybildande sträng under sanger-sekvensering.

I denna metod utförs fyra separata DNA-syntesreaktioner (PCR) i fyra separata rör med en typ av ddNTP. Övriga krav tillhandahålls också för rören för PCR inklusive primers, dNTPs, Taq polymeras, specifika betingelser etc. Fyra separata reaktioner utförs i fyra rör med fyra blandningar. Efter PCR-reaktioner är de resulterande DNA-fragmenten denaturerade och separerade genom gelelektrofores. Därefter visualiseras fragmenten genom att använda antingen en märkt (radioaktiv eller fluorescerande) primer eller dNTP som visas i figur 02.

Figur 02: Sanger-sekvensering

Vad är skillnaden mellan Maxam Gilbert och Sanger Sequencing?

Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert-sekvensering är den första tekniken utvecklad för DNA-sekvensering.	Sanger-sekvenseringsmetod infördes efter Maxam Gilbert-sekvenseringsmetoden.
Användande
Denna metod används sällan.	Sanger-sekvensering används rutinmässigt för sekvensering.
Användning av farliga kemikalier
Det använder farliga kemikalier.	Användning av farliga kemikalier är begränsad jämfört med Maxam Gilbert-metoden.
Märkning för detektion
Denna metod använder radioaktiv P32 för märkning av ändarna av DNA-fragmenten.	Sanger-sekvensering använder radioaktivt eller fluorescensmärkta ddNTPs.

Sammanfattning - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Maxam Gilbert och Sanger-sekvensering är två typer av DNA-sekvenseringstekniker som kommer under första generationens DNA-sekvensering. Maxam Gilbert-sekvensering är den första metoden införd för DNA-sekvensering 1976, och den utförs genom att bryta de slutmärkta DNA-fragmenten med basspecifika kemikalier. Det är därför känt som kemisk sekvensering. Sanger-sekvenseringsmetod introducerades 1977 och bygger på ddNTP-driven kedjestoppningsreaktioner. Sanger-sekvenseringsmetod populär än Maxam Gilbert-metoden på grund av flera nackdelar med Maxam Gilbert-metoden, såsom överdriven tidskonsumtion, användning av farliga kemikalier etc. Detta är skillnaden mellan Maxam Gilbert och Sanger-sekvensering.

referenser:
1.Maxam, A. M, och Walter Gilbert. "En ny metod för sekvensering av DNA." Förlopp från National Academy of Sciences. National Acad Sciences, 9 dec. 1976. Web. 30 mars 2017
2.Heather, James M., och Benjamin Chain. "Sekvensen av sekvenser: Historien av sekvensering DNA." Genomics. Academic Press, jan 2016. Web. 30 mars 2017
3.Pareek, Chandra Shekhar, Rafal Smoczynski och Andrzej Tretyn. "Sekventeringsteknik och genom-sekvensering." Journal of Applied Genetics. Springer-Verlag, nov. 2011. Web. 30 mars 2017

Image Courtesy:
1. "Maxam gilbert sequencing" av flera gånger på engelska Wikipedia (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-sequencing" Av Estevezj - eget arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia