Skillnad mellan varm och kall trypsinisering

Huvudskillnad - Varm vs Kall trypsinisering
 

Varm och kall trypsinisering är två metoder som används vid enzymatisk disaggregering av celler vid odling av djurceller. De nyckelskillnad mellan varm och kall trypsinisering, som namnen föreslår, beror på den temperatur vid vilken trypsinet tillsätts för cellulär disaggregation. Varm trypsinisering sker under högre temperaturförhållanden (36,5 - 37 ⁰C) medan kall trypsinisering sker under låga temperaturförhållanden.

Under processen med primärcellodling av djurceller är det tre huvudmetoder som utnyttjas och har visat sig vara framgångsrika. De tre metoderna innefattar mekanisk disaggregering av celler, enzymatisk disaggregering av celler och den primära explanttekniken. Den enzymatiska disaggregationen av celler som leder till isoleringen av celler och den görs genom det proteindraderande enzymet trypsin. Därför är denna process känd som trypsinisering. Trypsinisering kan utföras under två olika betingelser, nämligen varm trypsinisering och kall trypsinisering. Varm trypsinisering är metoden att behandla cellerna med trypsin under varma betingelser vid en temperatur av 36,5-37 ⁰C. Kall trypsinisering är processen för trypsinbehandling som sker under kallare betingelser, företrädesvis i isen som upprätthåller mycket låga temperaturer.

INNEHÅLL

1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är varm trypsinisering
3. Vad är Cold Trypsinization
4. Likheter mellan varm och kall trypsinisering
5. Jämförelse vid sida vid sida - Värme mot kall trypsinisering i tabellform
6. Sammanfattning

Vad är varm trypsinisering?

Trypsinisering kan göras för att disaggregera de cellulära komponenterna för att isolera cellerna för att producera en primärcellodling. Trypsin är ett proteindraderingsenzym, och den enzymblandning som användes vid trypsinisering kan antingen vara ett orent extrakt eller en renad produkt. Det råa extraktet sägs vara mer effektivt i proteinlys och celldesintegration eftersom det innehåller andra nedbrytande enzymer.

Varm trypsinisering är den vanligaste enzymatiska metoden för cell-disaggregering som sker under högre temperaturförhållanden. Före behandlingen genom trypsinisering hugsas den önskade vävnaden i mindre bitar. Det underlättar den enkla uppdelningen. Den hackade vävnaden tvättas sedan i ett speciellt medium som kallas Dissection Basal Salt-mediet.

Vid slutförandet av tvättsteget transformeras cellerna till en kolv innehållande det aktiva enzymet, vilket är trypsin. Eftersom denna teknik innebär ett varmt trypsiniseringsprotokoll placeras trypsinet vid en temperatur av cirka 37 ⁰C i ca fyra timmar.

Figur 01: Trypsin

Innehållet blandas och omröres med användning av centrifugeringsmetoder för protokollets lätthet och för att påskynda uppdelningsförfarandet. När den rekommenderade tiden uppnåtts kan cellerna härledas från supernatanten. Cellerna härledda från supernatanten inkuberas sedan vid en speciell temperatur och tid.

Vad är Cold Trypsinization?

Kall trypsinisering är den andra typen trypsinisering som sker under kalla förhållanden. I denna teknik placeras cellerna som hakas och tvättas i flaskor på is och sedan blötläggs med trypsin. Perioden för blötläggning är mycket längre - ca 6 - 24 timmar.

Efter avslutning av genomblötningsförfarandet avlägsnas trypsinet från celllysatet och vävnadsstyckena inkuberas vidare vid 37 ⁰C i ca 20-30 minuter. Disaggregeringen av cellerna åstadkommes genom upprepad pipettering av vävnadsblandningen. Detta kommer att tillåta cellerna att dissociera från membranet och komma till supernatanten. När cellerna är i supernatanten inkuberas de och odlas vid en önskad temperatur och tidsperiod.

Den kalla trypsiniseringsmetoden har flera fördelar

• Högre utbyte av livskraftiga celler som cellskador minimeras. Cellskadorna minimeras genom att inte använda centrifugeringssteg.
• Mycket bekväm metod.
• Mindre mödosamma.

Huvudbegränsningen för den kalla trypsiniseringsmetoden är att stora mängder inte kan användas i ett fall.

Vad är likheterna mellan varm och kall trypsinisering?

• Både varma och kalla trypsiniseringsprocesser använder enzymet trypsin för disaggregering av celler.
• Både varma och kalla trypsiniseringsprocesser används i cellodlingsprocedurer för disaggregering av celler.
• Vid både varm och kall trypsiniseringsbehandling, härledas cellerna från supernatanten.

Vad är skillnaden mellan varm och kall trypsinisering?

Varm kontra kall trypsinisering
Varm trypsinisering är metoden att behandla cellerna med trypsin under varma betingelser vid en temperatur av 36,5-37 0.	Kall trypsinisering är processen med trypsinbehandling som sker under kallare förhållanden, företrädesvis i is med mycket låga temperaturer.
Protokoll
De hackade vävnadstyckena bibehålls vid 37 0C kontinuerligt under hela proceduren.	De hackade vävnadstyckena upprätthålls initialt vid iskalla temperaturer och upprätthålls sedan vid 37 ° C 0.
Temperatur
Varm trypsinisering uppträder vid 36,5-37 0	Kall trypsinisering sker vid iskalltemperaturer.
Tid förbrukad
Mindre tid krävs för hela processen (cirka 4 timmar) av varm trypsinisering.	Längre tid krävs (cirka 6 - 24 timmar) för kall trypsinisering.
Utbyte av livskraftiga celler
Låg i varm trypsinisering.	Hög i kall trypsinisering.
Användning av centrifugering
Centrifugering krävs för disaggregering av celler i varm trypsinisering.	Centrifugering krävs inte vid kall trypsinisering.
Initialvävnadsmängd för trypsinisering
En större mängd vävnad kan användas vid varm trypsinisering.	En mindre mängd vävnad kan användas vid kall trypsinisering.
Cellskada
Hög på grund av centrifugering vid varm trypsinisering.	Mindre på grund av kall trypsinisering.

Sammanfattning - Varm vs Kall trypsinisering

Trypsinisering är metoden att använda det proteindraderande enzymet trypsin för disaggregering och framställning av primära cellkulturer under cellodlingsprocessen. Det finns två huvudsakliga tekniker för trypsinisering baserat på de temperaturer som används under proceduren. De är varma och kalla trypsinisering. Varm trypsinisering utförs vid 37 ⁰C medan kall trypsinisering utförs under iskalla förhållanden. Även om kall trypsinisering tar längre tid för slutförande, sägs det ha ett högre utbyte av livskraftiga celler. Detta beror på det faktum att cellskada minimeras vid kall trypsinisering, eftersom den inte använder kraftiga centrifugeringssteg. Detta är skillnaden mellan varm och kall trypsinisering.

Referens:

1. "Trypsinisering." Trypsinisering - en översikt | ScienceDirect-ämnen. Tillgänglig här 
2. "Primärcellskultur: 3 tekniker (med diagram)." Biologisk diskussion, 16 okt. 2015. Tillgänglig här  

Image Courtesy:

1.Trypsin aktiv plats "Med Fdardel - Egent arbete, (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia