Skillnad mellan Sanger Sequencing och Pyrosequencing

Huvudskillnad - Sångersekvensering mot Pyrosequencing
 

DNA-sekvensering är mycket viktigt för DNA-analys, eftersom kunskap om det korrekta nukleotidarrangemanget på en viss DNA-region avslöjar många viktiga uppgifter om det. Det finns olika DNA-sekvenseringsmetoder. Sanger-sekvensering och Pyrosequencing är två olika DNA-sekvenseringsmetoder som används ofta i molekylärbiologi. Den viktigaste skillnaden mellan Sanger-sekvensering och Pyrosequencing är det Sanger-sekvensering använder dideoxynukleotider för att avsluta syntesen av DNA för att läsa nukleotidsekvensen medan pyrosequensing detekterar pyrofosfatfrisättningen genom att inkorporera nukleotiderna och syntetisera den komplementära sekvensen för att läsa den exakta sekvensordningen.

INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är Sanger Sequencing
3. Vad är Pyrosequencing
4. Sida vid sida Jämförelse - Sångersekvensering mot Pyrosequencing
5. Sammanfattning

Vad är Sanger Sequencing?

Sanger-sekvensering är en första generationens DNA-sekvenseringsmetod utvecklad av Frederick Sanger och hans högskolor 1977. Det är också känt som Kedjetermineringssekvensering eller Dideoxisekvensering eftersom den är baserad på kedjestoppning av dideoxynukleotider (ddNTP). Denna metod användes allmänt i mer än 30 år tills New Generation Sequencing (NGS) utvecklades. Sanger-sekvenseringsteknik möjliggjorde upptäckten av den korrekta nukleotidordningen eller bindningen av ett särskilt DNA-fragment. Det är baserat på den selektiva införlivandet av ddNTP och termineringen av DNA-syntes under in vitro DNA-replikation. Frånvaron av 3'-OH-grupper för att fortsätta fosfodiesterbindningsbildning mellan intilliggande nukleotider är ett unikt drag hos ddNTP. När sålunda ddNTP är fastsatt upphör kedjeförlängningen och slutar från den punkten. Det finns fyra ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP och ddTTP - som används i Sanger-sekvensering. Dessa nukleotider stoppar DNA-replikationsprocessen när de införlivas i den växande DNA-strängen och resulterar i varierande längder av kort DNA. Kapillärgelelektrofores används för att organisera dessa korta DNA-strängar med sina storlekar på en gel, såsom visas i Figur 01.

Figur 1: Kapillärgelelektrofores av syntetiserad kort DNA

För in vitro replikering av DNA, få krav bör ges. De är DNA-polymerasenzym, mall-DNA, oligonukleotidprimrar och deoxinukleotider (dNTPs). Vid Sanger-sekvensering utförs DNA-replikation i fyra separata provrör tillsammans med fyra typer av ddNTPs separat. Deoxinukleotider ersätts inte fullständigt med respektive ddNTP. En blandning av den specifika dNTP (t ex dATP + ddATP) ingår i röret och replikeras. Fyra separata rörprodukter körs på en gel i fyra separata brunnar. Sedan genom att läsa gelén kan sekvensen konstrueras som visas i Figur 02.

Figur 02: Sanger-sekvensering

Sanger-sekvensering är en viktig teknik som hjälper till inom många områden av molekylärbiologi. Mänskligt genomprojekt avslutades framgångsrikt med hjälp av Sanger-sekvensbaserade metoder. Sanger-sekvensering är också användbar i mål-DNA-sekvensering, cancer- och genetisk sjukdomsforskning, genuttrycksanalys, humanidentifiering, patogendetektion, mikrobiell sekvensering etc.

Det finns flera nackdelar med Sanger-sekvensering:

• Längden av DNA som sekvenseras kan inte vara längre än 1000 baspar
• Endast en sträng kan sekvenseras åt gången.
• Processen är tidskrävande och dyr.

Därför utvecklades nya avancerade sekvenseringstekniker med tiden för att övervinna dessa problem. Sanger-sekvensering används dock fortfarande på grund av dess mycket exakta resultat upp till cirka 850 baspar längdfragment.

Vad är Pyrosequencing?

Pyrosequencing är en ny DNA-sekvenseringsteknik baserad på "sekvensering genom syntes". Denna teknik är beroende av detekteringen av pyrofosfatfrisättning vid nukleotidinkorporationen. Processen används av fyra olika enzymer: DNA-polymeriskt, ATP-sulfurylas, luciferas och apyra och två substrat adenosin 5 'fosfosulfat (APS) och luciferin.

Processen börjar med primerbindningen med den enkelsträngade DNA-mallen och DNA-polymeras startar inkorporeringen av nukleotider komplementära till den. När nukleotiderna förenas (nukleinsyrapolymerisation) frigörs pyrofosfat (två fosfatgrupper bundna) grupper och energi. Varje nukleotidtillägg frigör ekvimolär mängd pyrofosfat. Pyrofosfat omvandlas till ATP genom ATP-sulfurylas i närvaro av substrat APS. Den genererade ATP driver den luciferas-medierade omvandlingen av luciferin till oxifluciferin, vilket producerar synligt ljus i mängder som är proportionella mot mängden ATP. Ljus detekteras av en fotondetekteringsanordning eller genom fotomultiplikator och skapar ett pyrogram. Apyrase degraderar ATP och ej inkorporerade dNTP i reaktionsblandningen. dNTP-tillägg görs en gång i taget. Eftersom tillsatsen av nukleotid är känd enligt inkorporeringen och detektering av ljus kan mallens sekvens bestämmas. Pyrogram används för att generera nukleotidsekvensen för prov-DNA som visas i figur 03.

Pyrosequencing är mycket viktigt vid analys av enkel nukleotidpolymorfism och sekvensering av korta DNA-sträckor. Den höga noggrannheten, flexibiliteten, lättheten av automatisering och parallell bearbetning är fördelarna med pyrosequencing över Sanger-sekvenseringstekniker.

Figur 03: Pyrosequencing

Vad är skillnaden mellan Sanger Sequencing och Pyrosequencing?

Sanger-sekvensering mot Pyrosequencing
Sanger-sekvensering är en DNA-sekvenseringsmetod baserad på selektiv inkorporering av ddNTPs genom DNA-polymeras och kedjestoppning.	Pyrosequencing är en DNA-sekvenseringsmetod baserad på detekteringen av pyrofosfatfrisättning vid införlivandet av nukleotid.
Användning av ddNTP
ddNTPs används för att avsluta DNA-replikationen	ddNTPs används inte.
Enzymer involverade
DNA-polymeras används.	Fyra enzymer används: DNA-polymeras, ATP-sulfurylas, Luciferas och Apyrase.
Använda substrat
APS och Luciferin används inte.	Adenosin 5 'fosfosulfat (APS) och luciferin används.
Maximal temperatur
Detta är en långsam process.	Detta är en snabb process.

Sammanfattning - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Sångersekvensering och Pyrosequencing är två DNA-sekvenseringsmetoder som används i molekylärbiologi. Sanger-sekvensering konstruerar nukleotidernas ordning i följd genom att avsluta kedjeförlängningen medan pyrosequensionen konstruerar nukleotidernas exakta ordning genom inkorporering av nukleotider och detektering av frisättningen av pyrofosfater. Därför är huvudskillnaden mellan Sanger-sekvensering och Pyrosequencing att Sanger-sekvensering arbetar med sekvensering genom kedjans avslutning medan pyrosequencing arbetar med sekvensering genom syntes.

Referens:
1. Fakruddin, Md och Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-ett alternativ till traditionell sångsekvensering." American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Science Publications, 02 Mar. 2012. Web. 28 februari 2017.
2. "Sanger-sekvensering". Sanger-sekvensering - ScienceDirect-ämnen. N.p., n.d. Webb. 28 februari 2017

Image Courtesy:
1. "Didesoxy-Metode" Av Christoph Goemans (modifierande) - Dr. Norman Mauder, som grundare av Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" Av Enzo på det polska språket Wikipedia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" av mikrobiologibytes (CC BY-SA 2.0) via Flickr