Skillnad mellan NGS och Sanger Sequencing

Key Difference - NGS vs Sanger Sequencing
 

Nästa generationssekvensering (NGS) och Sanger Sequencing är två typer av nukleotidsekvenseringstekniker utvecklade över tiden. Sanger Sequencing-metoden användes ofta i många år och NGS ersatte den nyligen på grund av dess fördelar. Den viktigaste skillnaden mellan NGS och Sanger Sequencing är det NGS arbetar med principen om sekvensering av miljontals sekvenser samtidigt på ett snabbt sätt genom ett sekvenseringssystem medan Sanger Sequencing arbetar med huvudmannen för kedjeterminering på grund av selektiv inkorporering av dideoxynukleotider genom DNA-polymerasenzym under DNA-replikationen och resulterande fragmentseparation genom kapillär elektrofores.

INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är nukleotidsekvensering
3. Vad är NGS
4. Vad är Sanger Sequencing
5. Jämförelse vid sida vid sida - NGS vs Sanger Sequencing
6. Sammanfattning

Vad är nukleotidsekvensering?

Genetisk information lagras i nukleotidsekvenserna hos DNA eller RNA hos en organism. Processen att bestämma den korrekta nukleotidbeställningen (med användning av fyra baser) i ett givet fragment (i en gen, kluster av gener, kromosom och fullständigt genom) är känt som nukleotidsekvensering. Det är mycket viktigt i genomiska studier, rättsmedicinska studier, virologi, biologisk systematisk, medicinsk diagnos, bioteknik och på många andra områden för att analysera generens struktur och funktion. Det finns olika typer av sekvenseringsmetoder som utvecklats av forskare. Bland dem, Sanger-sekvensering utvecklad av Frederick Sanger 1977 användes allmänt och populariserades under en längre tid fram till Nästa generationssekvensering ersatt den.

Vad är NGS?

Nästa generationssekvensering (NGS) är en term som används för att referera till moderna processer för hög genomströmning. Det beskriver ett antal olika moderna sekvenseringsteknologier som revolutionerade genomiska studier och molekylärbiologi. Dessa tekniker är Illumina-sekvensering, sekvensering av Roche 454, Ion Proton-sekvensering och sekvensering av SOLiD (sekventering genom oligo-liggande detektion). NGS-system är snabbare och billigare. Fyra huvudsakliga DNA-sekvenseringsmetoder används i NGS-system nämligen; pyrosequencing, sekvensering genom syntes, sekvensering genom ligering och jon-halvledarsekvensering. Ett stort antal DNA- eller RNA-strängar (miljoner) kan sekvenseras parallellt. Det möjliggör sekvensering av hela genomet av organismer inom en kort tidsperiod, till skillnad från Sanger-sekvensering som tar längre tid.

NGS har många fördelar jämfört med konventionell sekvensering Sanger-metod. Det är en höghastighets, mer exakt och kostnadseffektiv process som kan utföras med en liten provstorlek. NGS kan användas i metagenomiska studier vid detektering av variationer inom ett individuellt genom på grund av insertioner och deletioner etc. och i analysen av genuttryck.

Figur_1: Utvecklingar i NGS-sekvensering

Vad är Sanger Sequencing?

Sanger Sequencing är en sekvenseringsmetod som utvecklats av Frederick Sanger och hans kollegor 1977 för att bestämma den exakta nukleotidordningen för ett givet DNA-fragment. Det är också känt som kedjestoppsekvensering eller Dideoxisekvensering. Arbetsprincipen för denna metod är uppsägningen av strängsyntes genom selektiv inkorporering av en kedjestoppande dideoxynukleotid (ddNTP) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP och ddTTP med DNA-polymeras under replikering av DNA. Normala nukleotider har 3'-OH-grupper för bildning av en fosfodiesterbindning mellan intilliggande nukleotider för att fortsätta strängbildningen. Dock saknar ddNTPs denna 3'-OH-grupp och kan inte bilda fosfodiesterbindningar mellan nukleotider. Därför upphör kedjeförlängningen.

I denna metod tjänar det enkelsträngade DNA som skall sekvenseras som mallsträngen för in vitro DNA-syntes. Andra krav är oligonukleotidprimer, deoxinukleotidprekursorer och DNA-polymerasenzym. När de flankerande ändarna av målfragmentet är kända kan primrar enkelt utformas för DNA-replikation. Fyra separata DNA-syntesreaktioner utförs i fyra separata rör. Varje rör har separata ddNTP, tillsammans med andra krav. Från den specifika nukleotiden tillsätts en blandning av dNTP och ddNTP. På samma sätt utförs fyra separata reaktioner i fyra rör med fyra blandningar. Efter reaktionerna utförs detektion av DNA-fragment och omvandling av fragmentmönstret till sekvensinformation. Resultatande DNA-fragment värmer denatureras och separeras genom gelelektrofores. Om radioaktiva nukleotider används kan bandningsmönstret i polyakrylamidgelen visualiseras genom autoradiografi. När denna metod använder de fluorescensmärkta dideoxynukleotiderna, kan den mildras ner på gelén som läses och passeras genom en laserstråle som detekteras av fluorescerande detektorn. För att undvika fel som kan uppstå när en sekvens läses av ögat och manuellt matas in i en dator, utvecklades denna metod till användningen av automatiserad sequencer kopplad till datorn.

Detta är metoden som används för att sekvensera DNA från Human Genome-projektet. Denna metod används fortfarande med avancerade ändringar eftersom det ger korrekt sekvensinformation trots att det är en dyr och långsam process.

Figur_2: Sångersekvensering

Vad är skillnaden mellan NGS och Sanger Sequencing?

NGS vs Sanger Sequencing
Nästa generationssekvensering (NGS) refererar till moderna processer för hög genomströmning. Den beskriver ett antal olika moderna sekvenseringstekniker	Sanger-sekvensering är en sekvenseringsmetod som utvecklats av Frederick Sanger för att bestämma den exakta nukleotidordningen för ett givet DNA-fragment.
Kostnadseffektivitet
NGS är en billigare process eftersom det minskar tid, makt och kemikalier.	Detta är en dyr process eftersom det tar tid, maktkraft och fler kemikalier.
Fart
Detta är snabbare eftersom både kemisk detektering och signaldetektering av många strängar sker parallellt.	Detta är tidskrävande eftersom kemisk detektering och signaldetektering sker som två separata processer och endast på strängen kan läsas åt gången.
Pålitlighet
NGS är pålitlig.	Sanger-sekvensering är mindre tillförlitlig
Provstorlek
NGS kräver mindre mängd DNA.	Denna metod behöver en stor mängd mall-DNA.
DNA-baser per sekvensfragment
Antalet DNA-baser per sekvenserat fragment är lägre än Sanger-metoden	Genereringssekvenser är längre än NGS-sekvenser.

Sammanfattning - NGS vs Sanger Sequencing

NGS och Sanger Sequencing är nukleotidsekvenseringstekniker som används extensivt i molekylärbiologi. Sanger-sekvensering är en tidig sekvenseringsmetod som ersattes av NGS. Huvudskillnaden mellan NGS och Sanger Sequencing är att NGS är en höghastighets, mer exakt och kostnadseffektiv process än Sanger-sekvensering. Båda teknikerna skapade stora utbrott inom genetik och bioteknik.

Referens:
1. Nowrousian, Minou. "Next Generation Sequencing Techniques for Eukaryotic Microorganisms: Sequencing-Based Solutions To Biological Problems." Eukaryotic Cell. American Society for Microbiology, september 2010. Web. 18 februari 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen och A. R. Coulson. "DNA-sekvensering med kedjestoppande hämmare." Förfaranden från National Academy of Sciences 74.12 (1977): 5463-467. webb.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu och Maggie Law. "Jämförelse av nästa generationssekvenseringssystem." Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. webb.

Image Courtesy:
"Sanger-sequencing" Av Estevezj - eget arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 
"Utvecklingar i nästa generations sekvensering" Av Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia