Skillnad mellan genkloning och PCR

Huvudskillnad - Gene Cloning vs PCR
 

Syntesen av många kopior av DNA från ett specifikt DNA-fragment kallas DNA-amplifiering. Det finns två huvudsakliga DNA-amplifieringsprocesser, nämligen genkloning och PCR. Nyckelförskjutningen mellan genkloning och PCR är, genkloning producerar flera kopior av en specifik gen in vivo genom att konstruera ett rekombinant DNA och växa inuti en värdbakterie medan PCR producerar miljoner kopior av ett specifikt DNA-fragment in vitro genomgår upprepade cykler av denaturering och syntes.

INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är genkloning
3. Vad är PCR
4. Jämförelse vid sida vid sida - Gene Cloning vs PCR
5. Sammanfattning

Vad är genkloning?

Genkloning är en teknik som används för att lokalisera och multiplicera en specifik gen från det extraherade genomiska DNA hos en organism genom konstruktionen av rekombinant DNA. Genomiskt DNA innehåller tusentals olika gener kodade för proteiner. När DNA extraheras innehåller det alla möjliga gener som den kan bära. Genkloningsteknik har möjliggjort detektering av en specifik gen från det totala DNA. Därför fungerar genkloning som ett viktigt verktyg inom molekylärbiologi.

Att göra ett genomiskt bibliotek av en organism är väsentligt vid genkloning om det inte finns någon aning om placeringen av den relevanta genen i DNA: n. Ett genomiskt bibliotek tillverkas med användning av följande steg.

Steg 1: Extraktion av total DNA från en organism som innehåller den önskade genen.

Steg 2: Restriktionsmältning av det extraherade DNA för att producera små hanterbara fragment. Detta steg underlättas av restriktionsendonukleaser.

Steg 3: Val av en lämplig vektor och öppnande av vektor-DNA med användning av samma restriktionsendonukleaser. Bakteriella plasmider används vanligen som vektorer för att bära främmande DNA. Plasmider är små cirklar av DNA som ligger inom bakterier.

Steg 4: Kombinering av vektor-DNA och fragmenterat DNA för att producera rekombinant DNA-molekyl. Detta steg styrs av DNA-ligas.

Steg 5: Överföring av rekombinanta DNA-molekyler till värdbakterier. Detta steg är känt som transformation och görs med hjälp av en värmechock.

Steg 5: Screening av transformerade bakterieceller på ett odlingsmedium. En blandad population av transformerade och icke-transformerade värdceller erhålles vid slutet av transformationsprocessen. Som gen av intresse ingår endast i transformerade värdceller. Därför är det nödvändigt att välja transformerade celler. Urvalet är tillverkat med selektiva medier som innehåller antibiotika. Endast de transformerade cellerna växer på detta screeningsmedium vilket möjliggör valet.

Steg 6: Växande av bakterier för att producera ett genbibliotek. I detta steg införs de transformerade värdcellerna i färskt odlingsmedium vilket ger optimala tillväxtkrav. Totala kolonier på odlingsplattorna representerar det genomiska biblioteket hos den organismen.

Steg 7: Den rekombinanta DNA-molekylen som innehåller genen av intresse måste screenas från tusentals klonade fragment av rekombinant DNA. Det kan åstadkommas genom användning av sonder som markerar den specifika genen eller det specifika proteinet resulterar från den genen.

När den intresserade genen som innehåller bakteriekolonien identifieras från de totala kolonierna är det möjligt att göra miljontals kopior av den rekombinanta plasmiden som innehåller genen.

Genkloning används för att upprätta genbibliotek, som producerar specialproteiner, vitaminer, antibiotika, hormoner, sekvensering och kartläggning genomer av organismerna, vilket gör flera kopior av individer DNA i rättsmedicin mm.

Figur_1: Gene Cloning

Vad är PCR?

Polymeraskedjereaktion (PCR) är en teknik som genererar ett stort antal kopior av ett visst DNA-fragment. Exponentiell amplifiering av en specifik DNA-sekvens erhålls genom PCR under in vitro betingelser. Denna teknik är ett mycket kraftfullt verktyg i molekylärbiologi eftersom det kan föröka ett litet urval av DNA till en användbar mängd. PCR introducerades av Kary Mullis 1983 och denna prisbelönta uppfinning skapade en stor framsteg inom molekylärbiologi.

PCR-tekniken följer upprepade PCR-reaktioner som visas i Figur 02. En PCR-reaktion består av tre huvudsteg som uppträder vid tre olika temperaturer; denaturering av dubbelsträngad vid DNA vid 94 ⁰C, annealing av primrar vid 68 ⁰C och strängförlängning vid 72 ⁰C. Därför, när PCR utförs, bör temperaturfluktuationen vara högt underhållen för korrekt replikering. PCR utförs i en PCR-maskin inuti PCR-rör. PCR-rören laddas med korrekta PCR-blandningar innehållande mall-DNA, Taq-polymeras, primrar, dNTP och buffert. Denaturering av dubbelsträngad prov-DNA i enkelsträngat DNA görs genom att bryta vätebindningarna mellan komplementära baser vid 94-98 ⁰C. Därefter exponeras enskilda strängar av mall-DNA för primers. Ett par primers (framåt och bakåt) bör tillhandahållas, och de bör vara termostabila för att tolerera höga temperaturer. Primers är enkelsträngade korta DNA-sekvenser komplementära till ändarna av mål-DNA-fragmentet. Syntetiska primers används i PCR. Primers binder med komplementära baser av prov DNA och initierar syntesen av en ny sträng. Detta steg katalyseras av ett enzym som kallas Taq-polymeras; ett termostabilt DNA-polymerasenzym isolerat från Thermus auqaticus. När primers och nukleotider (byggstenar) är tillgängliga konstruerar Taq-polymeras den nya DNA-strängen som är komplementär till mall-DNA. Vid slutet av PCR-programmet observeras amplifierat DNA-fragment med användning av gelelektrofores. Om ytterligare analys krävs, renas PCR-produkten från gelén.

PCR är mycket användbar för att diagnostisera och övervaka genetiska och förvärvade sjukdomar, identifiera brottslingar (inom rättsmedicinska området), studera strukturen och funktionen hos ett målinriktat segment av DNA, sekvensering och kartläggning av organismer, etc. PCR har blivit en rutinmässig laboratorieteknik inom medicinska och molekylärbiologiska forskningslaboratorier bland forskare eftersom det har ett brett utbud av applikationer.

Figur_2: Polymeraskedjereaktion

Vad är skillnaden mellan genkloning och PCR?

Gene Cloning vs PCR
Genkloning är processen att göra flera kopior av en specifik gen in vivo genom rekombinant DNA och omvandling till en värdbakterie.	PCR-tekniken producerar flera kopior av en viss DNA-sekvens in vitro genom upprepade cykler av PCR-reaktioner.
Krav på konstruktion av rekombinant DNA
Rekombinant DNA produceras för att lokalisera genen.	Rekombinant DNA produceras inte.
Behov av arbete
Denna process är arbetsintensiv.	Intensivt arbete är inte nödvändigt.
In vivo eller In vitro-process
Konstruktion av rekombinant DNA är in vitro och amplifieringen av DNA är in vivo.	Förstärkningen av DNA sker helt in vitro.

Sammanfattning - Gene Cloning vs PCR

Genkloning och PCR är två metoder som används för DNA-amplifiering. PCR är en in vitro process som gör flera kopior av DNA av ett visst DNA-fragment utan användning av rekombinant DNA och en värdorganisme. Genkloning är i första hand en in vivo process som resulterar i flera kopior av en intresserad gen inuti värdorganismen via konstruktion av rekombinant DNA. Detta är skillnaden mellan genkloning och PCR.

Referens:
1. Griffiths, Anthony JF. "Kloning av ett specifikt gen". Modern genetisk analys. U.S. National Library of Medicine, 01 jan 1999. Web. 22 februari 2017
2. "Polymeraskedjereaktion (PCR)." National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n.d. Webb. 22 februari 2017

Image Courtesy:
1. "Figur 17 01 06" Av CNX OpenStax - (CC BY 4,0) via Commons Wikimedia
2. "PCR" av Madprime - eget arbete (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia